淋巴细胞功能测定及其重要原理

知识目标

1、掌握淋巴细胞转化试验的基本原理

2、掌握溶血空斑试验检测B细胞功能的原理

课前思考

1.        复习淋巴细胞的功能，如何测定其功能？

2.        如何判别T淋巴细胞转化为母细胞？

3.        如何判别B淋巴细胞产生了抗体？

教学内容

淋巴细胞的功能测定

（一）T细胞功能检测

1、淋巴细胞转化试验

原理：T细胞在特异性抗原或有丝分裂原的作用下转变为淋巴母细胞（体积更大、代谢旺盛），根据其转化程度和转化率，测定机体细胞免疫功能状态。

刺激物分为两类：

（1）非特异性刺激物：如各种丝裂原（PHA、Con A、LPS等）、抗CD₂、抗CD₃、抗细胞表面标志的抗体以及某些细胞因子等，正常人T细胞转化率约为70%。

（2）特异性刺激物：主要是特异性可溶性抗原、细胞表面抗原、结核菌素（OT或PPD）。正常人T细胞转化率为：5%-30%。

不同刺激物可刺激不同淋巴细胞分化增殖，从而反映不同淋巴细胞亚群的功能状态。

测定方法：可采用放射性核素掺入法、比色法、荧光素标记法和形态学等方法。

（1）3H-TdR掺入法

在T细胞增殖过程中，胞内DNA、RNA合成增加，应用氚标记的胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）可掺入细胞新合成的DNA中，所掺入放射性核素的量与细胞增殖水平成正比。借助液体闪烁仪测定样品的放射活性，可反映细胞的增殖状况。该法灵敏可靠，应用广泛，但需特殊仪器，易发生放射性污染。

（2）MTT法

MTT是一种噻唑盐，化学名3-（4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5-二苯基溴化四唑，其掺入细胞后可作为胞内线粒体琥珀酸脱氢酶的底物，形成褐色甲臜颗粒并沉积于胞内或细胞周围，甲臢生成量与细胞增殖水平成正相关。甲臢可被盐酸异丙醇或二甲基亚砜完全溶解，借助酶标测定仪检测细胞培养物OD值，可反映细胞增殖水平。该法灵敏度不及3H-TdR掺入法，但操作简便，且无放射性污染。

（3）形态学计数法

淋巴细胞受丝裂原刺激后，转化为淋巴母细胞，其形态和结构发生明显改变，通过染色镜检，可计算出淋巴细胞转化率。

2、淋巴细胞参与的细胞毒性试验（LMC-T）(www.xing528.com)

CTL、NK细胞可直接杀伤不同靶细胞（如肿瘤细胞、移植供体细胞等）。通过检测杀伤活性可用于肿瘤免疫、移植排斥反应、病毒感染等方面研究。

（1）⁵¹Cr释放法

用Na₂⁵¹CrO₄标记靶细胞，被效应细胞杀伤的靶细胞释放⁵¹Cr，应用γ计数仪测定所释出的⁵¹Cr放射活性，可反映效应细胞的杀伤活性。

（2）乳酸脱氢酶（LDH）释放法

效应细胞-靶细胞进行反应并离心，借助比色法测定靶细胞膜受损后从胞内所释放出的乳酸脱氢酶活性，其水平反映效应细胞的杀伤活性。

（3）细胞凋亡检查法

效应细胞介导靶细胞凋亡时，内源性核酸水解酶将靶细胞DNA在核小体单位之间被切断，产生180~200bp（核小体单位长度）及其倍数的寡核苷酸片段，在琼脂糖电泳中呈现阶梯状DNA区带图谱，借此可反映细胞凋亡。

如需测定凋亡细胞数目及细胞类型，可在细胞培养物中加入末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxyribonucleotidyl transferase，TdT)和生物素标记的核苷酸，TdT能在游离的DNA 3‘端缺口连接标记的核苷酸，利用亲和素-生物素-酶放大系统，在DNA断裂处显色，从而指示凋亡细胞。该法所用标记核苷酸多为dUTP，故称TUNEL法(TdT dependent dUTP-biotin nick end labelling)。

3、分泌功能测定

检测免疫细胞所分泌细胞因子和抗体水平，可反映机体免疫功能状态。

（1）细胞因子分泌细胞的测定

细胞因子分泌细胞的测定常采用反向溶血空斑试验（RHPA）和酶联免疫斑点试验(ELISPOT)。RHPA检测原理是：将分泌细胞因子的待测细胞置于经SPA包被的单层SRBC中，抗细胞因子抗体被SPA固定在SRBC表面，并与待测细胞所分泌细胞因子结合。在补体存在时，细胞因子及其抗体形成的复合物可激活补体，溶解附近的红细胞形成溶血空斑。空斑大小与细胞分泌细胞因子的量成正比。

（2）抗体形成细胞测定

抗体形成细胞测定常用溶血空斑试验和定量溶血分光光度测定法。

溶血空斑试验即测定针对SRBC表面已知抗原的抗体形成细胞数目。其原理是：抗体形成细胞分泌的Ig与SRBC表面抗原结合，在补体参与下出现溶血反应。每一空斑中央含一个抗体形成细胞，空斑数目即为抗体形成细胞数。亦可采用RHPA和ELISPOT法检测抗体分泌细胞。

定量溶血分光光度测定法原理：根据溶血空斑试验原理衍化而来。将绵羊红细胞免疫小鼠后获得的脾细胞（含抗体形成细胞）与绵羊红细胞（SRBC）及豚鼠新鲜血清（补体）按一定比例混合，37℃水浴1小时后，SRBC溶解，释放血红蛋白，离心后上清液中的血红蛋白可用分光光度计定量测定。所获上清液吸光值与抗体形成细胞（浆细胞）分泌的抗体量成正比。

（1）直接溶血空斑试验法：检测分泌IgM的抗体形成细胞。

（2）间接溶血空斑试验法：检测分泌IgG或其他类别Ig的抗体形成细胞。

 方法：前两步与直接法相同，第三步需加入抗IgG或其他抗抗体，再加豚鼠新鲜补体进行观察

还有哪些方法可以用来检测淋巴细胞的功能？

1、写出T淋巴细胞转化试验的原理、步骤

2、设计一个方案来检测B细胞的功能