免疫学：人工制备抗体在疾病诊断和免疫防治中的重要作用

034.免疫球蛋白（04.制备）.ppt(下载附件 2.6 MB)

知识目标

1、掌握多克隆抗体制备的基本流程。

2、了解单克隆抗体制备的基本流程及应用

3、了解基因工程抗体的种类

课前思考

1.        中学学过的“生物导弹”是指什么？为什么取这个军事上的名字？

2.        上一讲提到过的破伤风抗毒素，你知道是怎么制备的？

3.        化验血型需要用到什么诊断试剂？你知道是怎么制备的？

教学内容

人工制备抗体

抗体在疾病诊断和免疫防治中发挥重要作用，故对抗体的需求越来越大。人工制备抗体是大量获得抗体的重要途径。早年人工制备抗体的方法主要是以相应抗原免疫动物，获得抗血清。由于天然抗原常含多种不同抗原表位，同时抗血清也未经免疫纯化，故所获抗血清是含多种抗体的混合物，即多克隆抗体 (polyclonal antibody)。用于制备抗血清的动物由早期的小鼠、大鼠、兔、羊等小动物发展到马等大动物，但所获抗体的质与量均不敷现代医学生物学实践之需。

1975年，Kohler和Milstein建立了体外细胞融合技术，获得免疫小鼠脾细胞与恶性浆细胞瘤细胞融合的杂交瘤细胞，从而使得规模化制备高特异性、均质性的单克隆抗体 (monoclonal antibody，McAb)成为可能。

一、多克隆抗体

在含多种抗原表位的抗原物质刺激下，体内多个B细胞克隆被激活并产生针对多种不同抗原表位的抗体，其混合物即为多克隆抗体。多克隆抗体是机体发挥特异性体液免疫效应的关键分子，具有中和抗原、免疫调理、介导CDC、ADCC等重要作用。在体外，多克隆抗体主要来源于动物免疫血清、恢复期病人血清或免疫接种人群。其特点是来源广泛、制备容易。多克隆抗体是针对不同抗原表位的抗体的混合物，而并非仅针对某一特定表位，其缺点是：特异性不高、易发生交叉反应，也不易大量制备，从而应用受限，图为多克隆抗体制备示意图。

二、单克隆抗体

制备单一表位特异性抗体的理想方法是获得仅针对单一表位的浆细胞克隆，使其在体外扩增并分泌抗体。然而，浆细胞在体外的寿命较短，也难以培养。为克服此缺点，Kohler和Milstein将可产生特异性抗体但短寿的浆细胞与无抗原特异性但长寿的恶性浆细胞瘤细胞融合，建立了可产生单克隆抗体的杂交瘤细胞和单克隆抗体技术。

单克隆抗体技术的基本原理是：哺乳类细胞的DNA合成分为从头(do novo)合成和补救(Salvage)合成两条途径。前者利用磷酸核糖焦磷酸和尿嘧啶，可被氨基喋呤（A）阻断；后者则在次黄嘌呤磷酸核糖转化酶（HGPRT）存在下利用次黄嘌呤（H）和胸腺嘧啶（T）；脾细胞和骨髓瘤细胞在聚乙二醇（PEG）作用下可发生细胞融合；加入HAT选择培养基（含H、A和T）后，未融合的骨髓瘤细胞因其从头合成途径被氨基喋呤阻断而又缺乏HGPRT不能利用补救途径合成DNA，因而死亡；未融合的脾细胞因不能在体外培养而死亡；融合细胞因从脾细胞获得HGPRT，故可在HAT选择培养基中存活和增殖。

融合形成的杂交细胞系称为杂交瘤(hybridoma)，其既有骨髓瘤细胞大量扩增和永生的特性，又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗体的能力。

单克隆抗体在结构和组成上高度均一，抗原特异性及同种型一致，易于体外大量制备和纯化。因此，其具有纯度高、特异性强、效价高、少或无血清交叉反应、制备成本低等优点，已广泛用于疾病诊断、特异性抗原或蛋白的检测和鉴定、疾病的被动免疫治疗和生物导向药物制备等。

三、基因工程抗体（genetic engineering antibody）(www.xing528.com)

单克隆抗体问世后，在生命科学理论研究和临床实践中得到极为广泛的应用。但是，迄今所获单克隆抗体多为鼠源性，鼠免疫球蛋白会使机体产生人抗鼠抗体反应，导致被快速清除，半衰期短，需给药次数多、剂量大，鼠抗体可能引起严重过敏反应。如何去除McAb的免疫原性而保留其免疫反应性？理想的方案是McAb只包含人的氨基酸序列，无鼠的氨基酸成分。即按不同的需要，将抗体的基因进行加工、改造和重新装配，然后再导入到适当的受体细胞内进行表达的抗体分子，这也就是第三代抗体。

与单克隆抗体相比，所具有的优点有：

1、通过基因工程技术的改造，可降低甚至消除人体对抗体的排斥反应；

2、基因工程抗体的分子量较小，可部分降低抗体的鼠源性，更加有利于穿透血管壁，进入病灶的核心部位；

3、可采用原核细胞、真核细胞和植物等多种表达方式，大量表达抗体分子，大大降低生产成本。

如人-鼠嵌合抗体（chimeric  antibody）、改型抗体（reshaped antibody）、双特异性抗体（bispecific antibody）、小分子抗体等。 

（一）人-鼠嵌合抗体（chimeric  antibody）

人-鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定区融合而得到的抗体（图4-14）。构建嵌合抗体的大致过程是：将鼠源单抗的可变区基因克隆出来，连到包含有人抗体恒定区基因及表达所需的其它元件(如启动子、增强子、选择标记等)的表达载体上，在哺乳动物细胞(如骨髓瘤细胞、CHO细胞)中表达。

            小鼠嵌合抗体                        改型抗体

（二）改型抗体或称CDR移植抗体

 CDR移植即把鼠抗体的CDR序列移植到人抗体的可变区内，所得到的抗体称CDR移植抗体或改型抗体，也就是人源化抗体（图4-15）。美国正式上市的11种治疗性单抗中多数是改型抗体，优点：（1）特异性较强；（2）不易发生变态反应；（3）在人体内维持的时间较长。 

（三）双特异性抗体

双特异性抗体是指能同时识别2种抗原的抗体（图4-16），一种为对应肿瘤相关抗原。另一种为对应效应成分，即能结合靶肿瘤细胞又能结合高细胞毒性的效应细胞，将效应细胞富集在肿瘤周围，实现对肿瘤细胞的杀伤和裂解。特点：除了能特异性识别肿瘤细胞外，还能将循环血液中的免疫效应细胞再导向至肿瘤细胞处，从而使效应细胞的抗肿瘤活性增强，发挥免疫导向作用。 

（四）小分子抗体

小分子抗体包括Fab、Fv或ScFv、单域抗体及最小识别单位等（图4-17）。小分子抗体有很多优点：可以用细菌发酵生产，成本低；分子小，穿透力强；不含Fc，没有Fc带来的效应；在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出；易于与毒素或酶基因连接，便于制备免疫毒素或酶标抗体。

1、SIgA是如何分布到机体管道（如肠道、阴道）表面的？

2、不同的Ig，其产生的时间、速度有区别吗？

1.        举例说明多克隆抗体制备的基本流程及应用。

2.        叙述单克隆抗体的概念、特性、应用及局限性。

3.        从杂交瘤技术的发明过程，对于科学研究有何启示？