学习细胞外记录方法，观察动作电位特性及药物影响

第五章　功能学科实验

第一节　神经、肌肉、感官系统实验

实验1．1　神经干动作电位电生理实验

【目的】学习神经干复合动作电位的细胞外记录方法，观察动作电位的传导速度、神经组织兴奋性的相对不应期和绝对不应期，测绘刺激时间—强度曲线，加深对神经干动作电位生理特性的理解及药物对其特性的影响。

【原理】神经是可兴奋组织，其兴奋的客观标志是动作电位，当神经干受到阈上刺激发生兴奋时，神经细胞膜在静息电位的基础上爆发动作电位，动作电位可沿细胞膜向远处传播;在神经干表面不同部位放置两对引导电极，神经干上一处在接受同一刺激后，根据两对引导电极所记录的两个动作电位的时间差，可计算其传导速度。当动作电位爆发时，其自身的兴奋性又会发生一系列的变化，先后经历绝对不应期、相对不应期、超常期和低常期等过程。在绝对不应期内给予刺激，即使加大刺激强度，细胞也不发生兴奋;在相对不应期内给予刺激，细胞可产生兴奋，但产生的动作电位幅度降低。引起细胞、组织或机体发生反应的刺激具有一定的强度、一定的持续时间，以及一定的时间—强度变化速率3个参数。用方波刺激细胞，相当于固定了刺激的时间—强度变化速率。在此情况下，可研究刺激强度和刺激持续时间两个参数的相互关系。

【动物】蟾蜍。

【药品与器材】蛙类手术器械，神经屏蔽盒，神经标本槽，棉线，直尺，SKY型生物信号处理系统，任氏液，1%利多卡因溶液，2%普鲁卡因溶液，0．87%氯化钾溶液，0．69%氯化钠溶液。

【实验步骤】

1．制备蟾蜍坐骨神经、腓神经标本

( 1)破坏脑和脊髓　左手持蟾蜍，腹部以下连同上肢握于手中，小指在下压住其双下肢(夹在小指和无名指之间)，用拇指压住背部，用示指向下压住吻部，使头与躯体成一定角度，充分暴露枕骨大孔部。用探针针尖沿头背部正中向下滑动，在两侧耳后缘连线前约3 mm处可触到一条横沟，将探针于横沟中央处经枕骨大孔向前刺入颅腔(图5- 1- 1)，探针向前稍向下左右搅动破坏脑，直至蟾蜍的角膜反射消失。然后将探针回抽至枕骨大孔，再转向后方插进椎管，边向尾椎推进边捻转，以损毁脊髓，直至动物的四肢瘫软。

图5- 1- 1　破坏蟾蜍脑、脊髓示意图

( 2)制备粗制标本　在蟾蜍的骶髂关节水平以上1cm处，用粗剪刀剪断脊柱，并将头和前肢连同所有内脏剪去，用左手拇指及示指夹住脊柱，右手由断面开始将皮肤与肌肉分离，向趾端方向剥去皮肤。避开坐骨神经，用粗剪刀从背侧剪去骶骨，然后沿中线将脊柱剪成左右两半，再从耻骨联合中央剪开(为保证两侧坐骨神经完整，避免剪时偏向一侧)。将已分离的标本浸入盛有任氏液的培养皿中。将此粗制标本置于蛙板上，脚掌向下用蛙钉固定，脊柱端的腹侧面向上，拉直后用蛙钉固定。洗净双手和用过的全部手术器械，再进行下列步骤。

( 3)分离坐骨神经和腓神经　先用玻璃分针沿脊柱侧游离坐骨神经腹侧部。再在其下肢股部背侧二头肌和半膜肌之间，用玻璃分针分离出坐骨神经的大腿部分，直至膝关节。坐骨神经在膝关节后分为胫神经和腓神经两支，在分叉下方将胫神经剪断，仔细分离腓神经并沿腓肠肌一直下行分离至跟腱。坐骨神经-腓神经完全暴露后，以粗剪刀剪下一小段与其相连的脊柱，或用线在靠近脊柱处将其结扎后并将向中端剪断。用镊子提起该小块脊柱或结扎线，以眼科剪逐一剪断坐骨神经在下行过程中的各个分支，游离并取下坐骨神经和与之相连的腓浅神经。分离过程中，操作必须精细，切忌用力牵拉和钳夹神经。神经标本尽可能长些。将神经干置于标本槽的电极上，盖上盖板，以防神经干燥。

图5- 1- 2　实验1．2仪器连接示意图

①第一对引导电极;②第二对引导电极

2．仪器联接　如图5- 1- 2所示，两对引导电极记录到的信号由通道1和通道2输入。输出D/A- 1或D/A- 2接标本槽刺激电极。

3．运行MFLab200．EXE　选择“神经干动作电位电生理实验”实验项目。调用菜单“文件/改变实验设置”功能，在相应对话框中输入两组引导电极间的实测距离。

4．进入“采集信号”界面，通过实验控制面板设置实验参数和控制实验进程放大器参数设置如下。

( 1)增益　根据信号幅度决定。

( 2)输入　正常。

( 3)低频滤波　1．6～16 Hz。

( 4)高频滤波　5～50 kHz。

( 5)刺激脉冲宽度　0．1 ms。

X轴扫描时间为10 ms，前延时时间为2 ms。脉冲1强度取0V，脉冲2强度取0V。

触发方式选“自动”，“自动扫描间隔”设定为1 000 ms，点击“启动”按钮，程序以每秒一次的间隔输出刺激脉冲，并在屏幕上显示两路信号。

逐步加大“脉冲1强度”，在屏幕上可看到动作电位的幅度逐渐增大。当动作电位幅度达最大时，停止加大“脉冲1强度”。改变放大器1和放大器2的增益，使信号幅度适中。

［实验一］神经干动作电位的传导速度

1．按“实验步骤4”操作，观察双相复合动作电位的幅度、时程及该电位在一定范围内随刺激强度变化而变化的过程。

2．单击“储存”按钮，程序在储存一幅信号后自动关闭“储存”功能(储存标志灯自动熄灭)。

3．在第一和第二对引导电极之间的神经干上放置浸有2%普鲁卡因的小棉球，按第1步操作观察动作电位的变化，并储存一幅信号。

单击“结束”按钮结束信号采集，返回浏览和测量页面。

4．传导速度测量是用浏览和测量窗口下方的滑动条选取记录。拖动滑动块可指向任意一个记录;单击滑动条两端的箭头左移或右移一个记录。

在第一个动作电位的起始点或峰顶处按下鼠标左键，鼠标处显示第一个垂直红色光标，移动鼠标，屏幕上显示另一个随鼠标移动的垂直红色光标。在第二个动作电位的起始点或峰顶处释放鼠标左键，屏幕右方显示两个光标的时间间隔和传导速度。

传导速度计算公式

式中，V为传导速度; L是两对引导电极的距离( m) ; T1和T2则分别为刺激起点至由第一和第二对引导电极记录到的动作电位的起始点或峰顶的时程( s)。传导速度测量方法参见图5- 1- 3。

图5- 1- 3　神经传导速度测定示意图

5．调用“文件/打印”功能，打印波形和数据，也可调用“页面生成BMP文件”功能，将图像和数据保存为图像文件，还可调用“区域拷贝”功能，将界面的某一区域直接粘贴到“画板”、Photoshop和Word等软件中去。

［实验二］神经干动作电位不应期

1．仪器连接同［实验一］，不同之处在于本实验仅记录第一对引导电极的信号，信号由通道1输入。

2．按“实验步骤4”操作，调节好“脉冲1强度”。

3．调节“脉冲2强度”，使之等于“脉冲1强度”。改变脉冲间隔，观察第二个动作电位的幅度变化情况，以此判断动作电位的相对不应期、绝对不应期、超常期和低常期。当第二个刺激脉冲落在绝对不应期内时，加大“脉冲2强度”，观察有无动作电位产生。

4．应用利多卡因　在刺激电极和引导电极之间的神经干上，放置一个浸有利多卡因的小棉球，观察动作电位的变化。

5．应用普鲁卡因　同［实验一］第3项。

6．补充项目　观察离子对动作电位的影响。①在上述实验结束后，立即将神经干放入任氏液内浸泡10～20 min，必要时反复更换新鲜任氏液，然后重新将神经干置于标本槽内，观察动作电位的恢复。②刺激强度2调至0V，在刺激电极和引导电极之间的神经干上，放一浸有0．87%氯化钾溶液的小棉球刺激参数固定不变，观察用药后动作电位的变化过程。③重复①和②项，以0．69%氯化钠溶液代替②项中的氯化钾溶液。

储存和图形输出方法参照［实验一］。

［实验三］刺激强度—时间曲线

1．仪器连接和程序操作同［实验二］。

2．调节“脉冲1强度”，使其刚好达阈刺激(在屏幕上刚好能看到动作电位)。储存一幅信号。

3．“脉冲宽度”递增0．1m，重复步骤2。脉冲宽度增至0．6～1ms时结束信号采集。

4．调用菜单“功能选择/计算与分析/双曲线拟合”功能，在列表框内按住Ctrl键用鼠标选择供拟合的数据，单击“确定”关闭列表框，屏幕显示双曲线(韦氏曲线)和有关数据。

储存和图形输出方法参照［实验一］。

【注意事项】

1．神经置于标本槽时，不要扭曲。

2．标本槽内不要加任氏液(但神经干标本应保持湿润，可间隔一段时间，在非观察期将神经干取出，浸于盛有任氏液的器皿中湿润后重新置于标本槽内)，棉球上的药液亦不宜过多，以防短路。

3．实验时，屏蔽盒要盖上盖子。引导电极、刺激电极的接地端应与屏蔽盒的接地柱相连。还要注意，屏蔽盒应与整个实验系统(包括仪器、电脑等)共同接地。

【思考题】

1．神经纤维的传导速度与哪些因素有关?

2．如何解释实验中的双向波形?

(薛红)

实验1．2　骨骼肌的单收缩与复合收缩，神经-肌接头兴奋的传递

【目的】观察刺激频率对肌肉收缩形式和收缩力的影响。通过观察箭毒对神经-肌接头传递的阻断效应来证明肌肉的收缩是神经冲动通过神经-肌接头的化学传递而实现的。

【原理】骨骼肌受躯体运动神经的支配。当躯体运动神经兴奋时，动作电位沿神经干传导至末梢，神经末梢释放乙酰胆碱，与肌纤维的终板膜上的特殊化学门控通道分子的两个α-亚单位结合，从而引起肌肉兴奋，通过兴奋-收缩耦联，使肌肉收缩。肌肉的每一次收缩是独立的、彼此分开的，即单收缩。单收缩全过程包括潜伏期、收缩期和舒张期。随着刺激频率的加快，前次刺激引起的收缩还未完全舒张时，新的刺激已到达肌肉，引起肌肉在尚未完全舒张的基础上出现新的收缩，表现为锯齿状的收缩波形，称为不完全强直收缩。若再增加刺激频率，前次刺激引起的收缩还未到达顶点时，新的刺激已到达肌肉，肌肉将出现完全的持续收缩状态，形成收缩力的叠加，曲线的锯齿形消失，即完全强直性收缩。而动作电位由于历时很短，又有不应期存在，所以不会融合。

【动物】蟾蜍或蛙。

【药品与器材】蛙类手术器械，肌槽，任氏液，箭毒，张力换能器，双极插入式刺激电极，刺激器。

【实验步骤】

1．制备蟾蜍坐骨神经-腓肠肌标本，破坏脑、脊髓至游离坐骨神经等步骤同坐骨神经-腓神经标本的制备(实验1．1)。将游离干净的坐骨神经搭于腓肠肌上，在膝关节周围剪掉全部大腿肌肉并用粗剪刀将股骨刮干净，然后在股骨中部剪断。用玻璃分针和镊子将腓肠肌跟腱分离并穿线结扎。在结扎处下端用粗剪刀剪断跟腱，左手执线提起腓肠肌，用眼科剪剪去周围组织，使之除上端仍附着于骨骼外，其他部分与小腿分离。在膝关节下将小腿剪去，这样就制得了坐骨神经-腓肠肌标本。它包括坐骨神经、一段股骨和腓肠肌(图5- 1- 4)。将其放入任氏液中稳定10 min，备用。

2．将标本置于肌槽中，股骨断端置于槽侧壁的骨孔中，旋紧螺丝钉使之固定，坐骨神经放置在刺激电极上。

图5- 1- 4　坐骨神经-腓肠肌标本制备示意图

3．将腓肠肌肌腱上的丝线系于张力换能器的着力点上，调节肌槽与换能器之间的位置和距离，使丝线处于垂直位置并刚好拉紧不松弛，令肌肉处于自然拉长的长度，坐骨神经干置于记录电极和刺激电极上(图5- 1- 5)。

4．将张力换能器连接到“生物信号处理系统”的通道1(图5- 1- 6)。开启“生物信号处理系统”，运行MFLab200．EXE，选择“骨骼肌单收缩及复合收缩”实验项目。进入“采集信号”界面，设置放大器参数。放大器参数如下。

( 1)增益　根据信号幅度决定。

( 2)输入　正常。

( 3)低频滤波　直流( DC)。

( 4)高频滤波　0．5～5 kHz。

图5- 1- 5　肌张力测定装置

( 5)刺激脉冲宽度0．1 ms。

图5- 1- 6　实验1．1仪器连接示意图

5．确定肌肉阈上刺激强度，调节肌肉最适初长。

刺激脉冲宽度调至0．1ms，刺激方式设为单刺激。先调节刺激器输出强度，使肌肉产生收缩。再调节肌肉长度，使肌肉收缩张力达到最大。

【观察项目】

1．单收缩的曲线描记　扫描速度设为每屏20～40 ms。以单个方波刺激坐骨神经引起腓肠肌单收缩，改变刺激强度，记录多个收缩波。注意观察刺激强度与肌肉收缩张力之间的关系，由此确定最适刺激强度，即刚好能引起肌肉最大收缩张力的刺激强度。在“信号浏览和测量”界面，测量肌肉收缩的3个时期(潜伏期、收缩期和舒张期)的时间长短。

2．复合收缩曲线的描记　扫描速度设为每屏1．28 s。刺激器串长设为1 s，刺激强度和脉冲宽度同前。以不同频率( 1、2、4、8、16、32、50 Hz)刺激标本，每次刺激间隔时间为5 s。观察不完全及完全强直收缩的波形和波幅变化，选取典型图形储存。

3．观察箭毒对神经-肌接头传递的阻断效应　固定各项参数不变，在腓肠肌的两端肌肉内各注射箭毒1mg ( 0．1ml )，并用浸泡有箭毒的薄层棉花覆盖于腓肠肌上，2 min后刺激神经干，观察肌肉收缩波的变化。以后每隔2 min刺激一次，观察多少时间后肌肉收缩波完全消失。肌肉收缩波完全消失后，再用刺激电极直接刺激肌肉，观察其反应。

【注意事项】

1．在制备标本的过程中，注意勿损伤坐骨神经和腓肠肌。

2．在实验中应经常滴加任氏液于标本，以保持标本的湿润，但一次不宜加入过多，以免引起线路短路。

3．用最适刺激强度刺激神经，避免过强刺激损伤神经。

【思考题】

1．为何神经肌肉标本中肌肉收缩随刺激强度的增加而增强?

2．箭毒对肌肉收缩有何影响?机制如何?

(张　威)

实验1．3　诱发脑电实验

【目的】学习哺乳动物大脑皮质诱发电位的记录方法，了解其波形特征和形成原理。

【原理】大脑皮质诱发电位是指感觉传入系统受到刺激时，在大脑皮质某一局限区域引出的电位变化。由于皮质一直处在活动状态并产生自发脑电波，因此诱发电位往往出现在自发脑电波的背景上。在皮质相应的感觉区表面引出的诱发电位可分为主反应、次反应和后发放3个部分。主反应之前的潜伏期一般为5～12 ms(较恒定)，主反应一般为先正后负的电位变化，在大脑皮质有特定的部位，它是大锥体细胞电活动的综合表现。次反应是跟随主反应之后的扩散性续发反应，后发放的出现则不太恒定，与刺激强度和麻醉状态有关。由于诱发脑电主反应与刺激信号具有锁时关系，而诱发脑电其他成分及自发脑电则具有随机特性，利用这一特点，可应用计算机对电位变化的叠加平均处理，使诱发脑电的主反应突显出来，而其他成分则互相抵消。

本实验采用细胞外记录方法，通过刺激豚鼠坐骨神经，在皮质后肢代表区记录到相应的诱发电位。

【动物】豚鼠。

【药品与器材】哺乳动物手术器械，骨钻，骨钳，皮质电位引导电极，保护电极，ST3ND-脑立体定位仪，SKY型生物信号处理系统，1．5%戊巴比妥钠(或20%乌拉坦，或氯醛糖与乌拉坦混合液)，苯巴比妥。

【实验步骤】

1．以1．5%戊巴比妥钠30～40mg/kg(或20%乌拉坦溶液1 000～1 400mg/kg)腹腔注射麻醉。

2．豚鼠取俯卧位，在右后肢沿大腿后外侧纵轴切开皮肤，于股二头肌和半膜肌之间的深处找到坐骨神经，并用玻璃分针将其分离、穿线，把神经置于保护电极上。

图5- 1- 7　钻空位置

3．头顶部剪去被毛，沿正中线切开豚鼠头部皮肤(两眼连线中点至枕骨的连线)，用刀柄钝性分离骨膜，暴露颅骨缝，在左侧颅骨上(冠状缝与矢状缝交界处后外侧，稍向后偏移，见图5- 1- 7中标有“记录部位”处)钻一圆孔暴露一侧大脑体感区皮质，止血。钻孔时切忌用力过猛，以免损伤皮质，否则将难以引导出皮质诱发电位。

4．上述手术完成后，将豚鼠头部稳妥固定于脑立体定位仪上。如电波有干扰，可对立体定位仪进行接地处理。

5．连接实验装置(图5- 1- 8)。

图5- 1- 8　实验1．3仪器连接示意图

6．连接电极，使参考电极夹在头皮切口边缘上，引导电极头端接触大脑皮质相应的体感区。

7．运行MFLab200．EXE，选择“诱发脑电实验”。

8．进入“采集信号”界面，通过实验控制面板设置实验参数和控制实验进程。放大器参数设置如下。

( 1)增益　根据信号幅度决定。

( 2)输入　正常。

( 3)低频滤波　1．6～16 Hz。

( 4)高频滤波　5～50 kHz。

( 5)刺激脉冲宽度　0．1 ms。

9．观察皮质自发脑电波　通过实验控制面板设置实验参数和控制实验进程。X轴扫描时间为80～640 ms。“脉冲1强度”取0V。

触发方式选“自动”，“自动扫描间隔”设定为1 000 ms，点击“启动”按钮，程序以每秒一次的间隔输出刺激脉冲，并在屏幕上显示脑电信号。

调整放大器1增益，使自发脑电清晰可辨、幅度适当。

10．诱发脑电叠加X轴扫描时间为20～40 ms，观察后发放电位时，设为160～320 ms。前延时时间为4ms左右。点击“启动”按钮，逐步加大“脉冲1强度”，可见同侧肢体轻微抖动，在屏幕上观察辨认皮质诱发电位。移动引导电极，以1 mm间距探查暴露的皮质区域，寻找诱发电位幅度最大且恒定的中心区域。

单击“储存”按钮，程序开始储存信号并在屏幕上显示叠加后的曲线。叠加后曲线的Y轴尺度可由相应的按钮放大或缩小。等叠加后曲线满意，再单击“储存”按钮，停止叠加。单击“结束”按钮，退出“采集信号”功能。

调用菜单“功能选择/计算与分析/叠加平均”功能，程序弹出一个对话框。在对话框内输入供叠加的信号的起始号和结束号，屏幕显示叠加后的曲线。

在叠加波形显示区按下鼠标左键，屏幕上出现一垂直光标，按住左键不放，滑动鼠标，屏幕下方显示光标处的时间和信号幅度。

调用相关功能以改变Y轴尺度和打印波形等。

11．在皮质投射区滴加苯巴比妥，观察药物对诱发脑电的影响。

【注意事项】

1．麻醉深度以呼吸减慢、角膜反射消失、夹趾无明显反应、自发脑电稳定为度，切忌麻醉过深。

2．手术过程中尽量减少出血，切勿损伤皮质(钻孔时向下和旋转的力要均匀分配，防止颅骨下陷;引导电极头部圆钝，接触皮质时切忌向下按压)。

3．主反应投射区域局限，引导电极放置位置要找准。可在一定范围内移动电极与皮质的接触点位置，直至找到最佳位置。

【思考题】

如何确定某一波形是主反应而非干扰波或自发脑电?

(刘　俊)

实验1．4　耳蜗微音器电位

【目的】学习微音器电位的引导方法，观察微音器效应。

【原理】当声波刺激耳蜗时，在耳蜗及其附近的结构所记录到的一种与声波波形和频率一致的电位变化就是微音器电位。如将这种电位变化经放大后输入监听器，可听到与刺激声波相同的并放大了的声音，这种效应称为微音器效应。

【动物】豚鼠。

【药品与器材】哺乳动物手术器械、小骨钻、前置放大器、示波器、监听器、银丝引导电极、三向推动器、收音机、20%氨基甲酸乙酯溶液、0．9%NaCl。

【实验步骤】

1．安装引导电极　将前置放大器的输入端通过导线与引导电极、无关电极相连;其输出端通过导线与生物电放大器相连，放大器的输出接监听器。选择相应的电脑程序。

2．手术　取体重300～400g的年幼豚鼠1只(年幼豚鼠耳蜗位置较浅)，腹腔注射20%氨基甲酸乙酯溶液( 6ml/kg)。待动物麻醉后，沿耳郭根部的后缘切开皮肤，分离组织，剔净肌肉，暴露外耳道口后方的颞骨乳突部。用小骨钻在乳突上钻一小孔，并仔细扩大成直径为3～4 mm的骨孔。借放大镜经骨孔向前方深部窥视，在相当于外耳道口内侧的深部，可见自上而下向上兜起的耳蜗底转的后上部分及底转上方的圆窗。圆窗口朝向外上方，其前后径约为0．8 mm。豚鼠取侧卧位，使其头部嘴端稍向下垂，以便于电极插入。操纵三向推动器将银丝引导电极经骨孔向前深部插入，使电极球形端与圆窗膜接触。参考电极夹在切口皮下组织(图5- 1- 9)。

图5- 1- 9　豚鼠耳蜗电极引导法

①引导电极;②枕骨大孔;③固定螺丝钉;④乳突部骨孔暴露圆窗膜;⑤外耳道;⑥鼓泡

【观察项目】调节好放大器的放大倍数。试对豚鼠外耳道说话，计算机上可见与声音同步发生的电位变化，从监听器可以听到同样的话语声。

【注意事项】

1．引导电极头端应熔成球形，直径约0．5 mm，并在其外套一塑料管。

2．安置电极时，勿将圆窗戳破，否则外淋巴流出，微音器效应将明显减弱。

【思考题】

比较耳蜗微音器电位和听神经动作电位。

(薛　红)

实验1．5　有机磷中毒机制、症状及药物治疗

【目的】观察阿托品和碘解磷定(解磷定)对敌百虫中毒的解救作用，并从血液中乙酰胆碱酯酶( Acetylcholinesterase，AChE)的活性改变来进一步观察药物的作用机制。

【实验对象】家兔，2．5～3．0 kg。

【药品与器材】5%敌百虫，0．05%阿托品，2．5%碘解磷定，乙酰胆碱酯酶测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)，蒸馏水，兔箱，5、10 ml注射器，10、100、1 000 μl微量可调移液器，棉花，卫生纸，搪瓷盘，瞳孔尺，试管，试管架，离心机，752型分光光度计，0．5 cm光径玻璃比色皿，天平，小烧杯，手术刀片，恒温水浴锅。

【实验步骤】

1．取家兔一只，称体重。首先观察并记录该兔的正常指标:瞳孔大小、唾液分泌、大小便及有无肌震颤等情况。

2．用手术刀片或剃须刀片割破兔耳较厚一侧的耳缘静脉(应先从近耳根处血管开始割，逐次向耳尖方向换位，取血后用棉球压迫止血)，使血流出形成液滴，用10 μl移液器直接吸取血液10 μl，迅速吹入盛有0．99 ml生理盐水的小试管内，立即充分混匀，制成1∶99全血稀释液，作好标记，用作胆碱酯酶测定的正常对照。

3．给同一耳朵另一侧的耳缘静脉注射5%敌百虫75mg/kg，并记录给药时间，尽可能一次注射成功(因注射敌百虫后该处血管将会变性甚至坏死)。待中毒症状明显时记录作用时间，观察上述指标有何改变。

4．紧接上步，按步骤2从耳缘静脉取血10 μl，同样制成1∶99全血稀释液;然后从另一耳朵的耳缘静脉注射0．05%阿托品1 mg/kg(保留该侧静脉通路，以备后面静注药液之用)，再观察上述指标有何改变。待作用明显时记录作用的时间。

5．紧接上步，从耳缘静脉注射2．5%碘解磷定75mg/kg，再观察上述指标有何改变。待作用明显时记录作用时间。给碘解磷定120 min时按上法取血并制成1∶99全血稀释液，测定乙酰胆碱酯酶活性。

【症状指标的观察法】

1．瞳孔　直接用瞳孔尺量出左、右两侧瞳孔的直径( cm)，测量时注意光线强　　　　 弱应相同。

2．唾液　用双层草纸贴在兔嘴部，看纸上水印大小，按分泌量的多少以－、

3．大小便按量的多少以－、+、+ +、+ + +表示:

4．肌震颤按程度不同以－、+、+ +、+ + +表示:

【乙酰胆碱酯酶活性测定】

1．原理　乙酰胆碱酯酶水解乙酰胆碱生成胆碱及乙酸，胆碱与巯基显色剂反应生成TNB黄色化合物，根据颜色深浅进行比色定量，水解产物胆碱的数量可反应胆碱酯酶的活力。

2．试剂组成及配制

( 1)试剂一，标准品:粉剂6支，4℃保存。

1μmol/L标准应用液的配制:取标准品1支加生理盐水10ml混匀，现用现配。

( 2)试剂二，底物粉剂3支，用时每支粉剂加生理盐水20 ml，现用现配，配好后4℃保存2周。

( 3)试剂三，显色剂贮备液:6ml×1支，4℃保存，用时以生理盐水1∶9稀释，配成显色应用液。需多少配多少，也可以一次配成60ml，避光冷藏，保存期3个月。

( 4)试剂四，抑制剂:液体2支。打开后可装在空的小塑料瓶内(附空瓶1只)，室温保存。

( 5)试剂五，透明剂:液体6 ml×2支，室温保存，天冷时会有沉淀或混浊，须37℃水浴加热至透明后方可使用。

( 6)试剂六，稳定剂:粉剂3支，4℃保存。用时每支加10 ml蒸馏水混匀，避光冷藏保存5 d。

( 7)生理盐水: 60 ml×3瓶，室温保存。

3．操作　按表5- 1- 1操作。

表5- 1- 1　胆碱酯酶测定操作步骤

混匀，室温放置15 min，412 nm，0．5 cm光径，蒸馏水调零比色。
【注】①测定空白必须每个样本都做，因为每个样本测定空白的吸光度差异较大。
②比色前试管室温放置15 min，若室温过低，可能会出现沉淀或混浊，此时，请将试管置于37℃水浴中片刻，即可澄清，澄清后方可比色，且对实验结果无影响。
③因反应时间较短，故批量测试时，每批所测样本不可过多，准确控制反应时间，否则会影响实验的精确度。

4．计算公式及单位定义

( 1)胆碱酯酶活力单位定义1 ml全血在37℃保温6 min，水解反应体系中1 μmol基质为1个活力单位。

( 2)胆碱酯酶活力单位计算公式

( 3)计算举例取1∶99全血稀释液0．1 ml测定胆碱酯酶活力，得测定管OD值为0．492，测定空白管OD值为0．312，标准管OD值为0．324，标准空白管OD值为0．060，标准管浓度为1 μmol/ml，计算如下:

【注意事项】

1．注射敌百虫时，尽可能避免将药液注射到血管外，否则血管将不可再用。可先用生理盐水针穿刺血管，待确认进入血管后，保留针头，更换敌百虫针筒，再行注药，注药完毕，再用生理盐水适量注入，以驱尽局部血管内的药液。

2．注射敌百虫后，随即将碘解磷定、阿托品等药液预先抽好，并准备好注药的耳缘静脉通路。

3．如用敌百虫后15 min不出现中毒症状，可酌量补给。

4．实验用具及试管需干燥清洁。

5．各血样的保温时间需准确。

6．添加各种试剂时严格按照操作顺序。

【思考题】

1．敌百虫中毒后哪些症状可用阿托品对抗?哪些症状则不能对抗?为什么?

2．严重敌百虫中毒后，为何常合并应用阿托品和碘解磷定进行解救?

3．根据实验结果分析敌百虫的中毒机制及阿托品和碘解磷定的解毒机制?

【结果记录】

表5- 1- 2　家兔敌百虫中毒及药物治疗的症状观察

表5- 1- 3　家兔敌百虫中毒及药物治疗的血液胆碱酯酶活力测定

(郭凌鸿)

实验1．6　用热板法观察哌替啶等药物对小鼠的镇痛作用

【目的】用小鼠热板法比较哌替啶和安乃近镇痛作用的不同。

【原理】将小鼠置于一定温度的热板上，从开始置入时至小鼠由于痛感而发生舔后脚为止的时间作为痛阈。测定用药组和对照组对痛阈提高的程度，来说明各药的镇痛作用。

【动物】小鼠。

【药品与器材】水浴锅、温度计、热板、测验器、0．4%哌替啶、3%安乃近、生理盐水。

【实验步骤】

1．准备工作　记录室温，将水浴锅加水，使水面触及热板，通过恒温装置将水浴加热，使水的温度保持在( 55±0．5)℃(必须准确)。小组进行分工:一人看表发令，一人拿鼠及观察，一人保持温度和担任记录。

2．小鼠的选择及正常痛阈值的测定　当看表人发令时，立即将一鼠放入测验器内，并密切观察。正常时，小鼠一般在放入后10～20 s内开始有不安状态，可能有举前肢、踢后肢等动作，以上动作均不易确定，而以舔后脚或跳跃的动作为痛觉的指标，并立即记录时间，将鼠取出。用此法选出反应在30s内的小鼠3只。合适小鼠挑选后，再依次测小鼠正常痛阈值一次，将每只小鼠所得的两次正常痛阈值的平均值作为给药前痛阈值。

3．给药前及给药后的痛阈测定　称好体重的小鼠，作记号，按下列剂量计算各鼠所需的药液，再依次每隔＞1min和＜3min的时间(自定)分别给予下列药物:

第一鼠:腹腔注射0．4%哌替啶40 mg/kg。

第二鼠:腹腔注射3%安乃近300 mg/kg。

第三鼠:腹腔注射生理盐水102 ml/kg。

注射完毕后，从第一只鼠给药时间算起，每10 min测定各鼠痛阈值一次(如60 s内仍无反应者，亦应把鼠取出作60s记录，因为时间太久会把脚烫坏)，直到用药后1 h为止，共测痛阈值6次。列表记录结果。

4．计算　根据全班实验结果，按下列公式计算不同时间的镇痛反应百分率

根据每药不同时间的镇痛反应百分率作图，横坐标代表时间，纵坐标代表镇痛反应百分率，画出各药的曲线。比较各药的镇痛强度、作用开始时间及维持时间。

【注意】雌性小鼠较好。观察各鼠痛阈时，间隔时间要恒定，不要随意改变，否则将扰乱整个实验的秩序。

【记录】实验室温度

【注意】经常用玻棒搅动水浴，使温度均衡。

【思考题】

1．比较哌替啶和安乃近的镇痛作用特点，讨论在临床应用中两者各有何实际意义?

2．哪些因素可以影响本次实验的结果?

3．小鼠正常痛阈的标准过高或过低对实验结果有什么影响?

(杨素荣　郭凌鸿)

第二节　心血管系统实验

实验2．1　心血管活动调节及药物的影响

【目的】学习家兔动脉插管术和血压描记方法，观察夹闭颈总动脉、刺激颈迷走神经、降压神经及传出神经系统药物［如阿托品、肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素、酚妥拉明、普萘洛尔(心得安)］对家兔血压和心率的影响。

【原理】心血管活动受交感和副交感神经支配。心交感神经兴奋时，其末梢释放去甲肾上腺素，作用于心肌细胞膜上的β1受体，使心率增快、收缩力增强，导致心输出量增加、动脉血压升高。心迷走神经兴奋时，其末梢释放乙酰胆碱，作用于心肌细胞膜上的M受体，使心率减慢，心房肌收缩力减弱，导致心输出量减少，动脉血压降低。交感缩血管神经兴奋时其末梢释放去甲肾上腺素，作用于血管平滑肌的α受体，使血管收缩，导致外周阻力增加、动脉血压升高。神经系统对心血管活动的调节是通过各种反射来实现的，其中最重要的是压力感受性反射。电刺激降压神经，通过降压反射引起心率减慢、心肌收缩力减弱、血管舒张、血压下降。此外，心血管活动还受体液因素的调节，通过给予传出神经系统的药物可帮助了解心血管活动的体液性调节。

【动物】家兔。

【药品与器材】1．5%戊巴比妥钠溶液(或20%乌拉坦溶液)、0．1%肝素溶液、1∶10 000肾上腺素溶液、1∶10 000去甲肾上腺素溶液、1∶10 000异丙基肾上腺素溶液、生理盐水;哺乳动物手术器械一套、保护电极、压力换能器、塑料三通开关(阀)、“Y”形气管插管、动脉夹、10 ml注射器、卡介苗注射器、头皮针、SKY型生物信号处理系统。

【实验步骤】

1．准备检压系统　通过三通开关向压力换能器内注满生理盐水，并向动脉插管内灌满0．1%肝素溶液，务必驱尽管道系统内的空气，然后关上三通开关备用。

2．称重、麻醉与固定　取家兔一只，称重后从兔耳缘静脉缓慢注射1．5%戊巴比妥钠溶液30mg/kg，或20%乌拉坦溶液750～1000mg/kg进行麻醉，然后将动物仰卧位固定在手术台上(室温较低时可打开手术台底面电灯保温)。

3．手术　用粗剪刀剪去颈部手术部位兔毛，在颈部沿正中线切开皮肤5～7 cm，分离皮下组织，于正中线分开肌肉，暴露气管，在甲状软骨下约1 cm处剪一“⊥”形切口，插入“Y”形气管插管，注意插管插入时应使插入端的斜口向下，插入2～3 cm后将插管旋转180°，使插入端的斜口向上，并用先前穿好的备用线扎紧，再将余线绕气管插管的分叉处扎紧打结，以防滑脱。将切口边缘的皮肤及其下方的肌肉组织向外侧拉开，即可见在气管两纵行的左、右颈总动脉、颈迷走神经。交感神经和降压神经与颈总动脉伴行，行走于同一颈总动脉鞘内。仔细辨认3条神经，颈迷走神经最粗，颈交感神经次之，降压神经最细，且常与颈交感神经紧贴在一起(图5- 2- 1)，可用玻璃针先分离右侧降压神经，然后分离右侧颈迷走神经、交感神经和颈总动脉。每根神经、血管分离出3～4 cm长，并在各神经、血管下穿一条不同颜色的丝线备用。

图5- 2- 1　兔颈部神经、血管解剖位置示意

4．动脉插管　分离左侧颈总动脉，尽可能向头端游离，穿线并结扎头端，用动脉夹夹住其近心端，结扎处与动脉夹夹闭间的颈总动脉长度约需3 cm。在血管下穿线备用。用眼科剪在头端结扎线下方0．5 cm处的动脉壁上作一斜切口，切口约为管径的一半，然后将准备好的动脉插管由切口处向心脏方向插入动脉内。用已穿好的线扎紧插入血管的动脉插管，并用同一线在插管线上方约2 cm处再打结固定，以防插管滑脱。细心剪断该动脉在头端结扎处与动脉插管插入处之间部分，以防该侧颈动脉窦过分牵拉。使动脉插管与动脉保持在同一直线上，然后用胶布将动脉插管固定在手术台上。放开颈总动脉上动脉夹，同时旋转三通开关旋钮，使动脉插管与压力换能器之间相通。

5．实验装置的连接　按图5- 2- 2连接实验装置，信号由通道1输入。调节好压力放大器的位移和增益，D/A- 1的输出接刺激电极。

图5- 2- 2　仪器连接示意图

6．运行MFLab200．EXE选择“心血管活动调节及药物的影响”，单击“确定”。

在菜单“功能选择”项下选择“采集信号”或直接单击工具条上的“采集信号”图标。启动采样后，屏幕中间为信号显示窗口。屏幕右边为实验控制面板。

通过实验控制面板设置实验参数和控制实验进程。X轴扫描时间根据需要设定，“刺激频率”取20 Hz，“刺激时间”根据需要设定，“脉冲宽度”取0．1 ms。“脉冲1强度”取0．1～1 V。低频滤波选DC，高频滤波选0．5～5 kHz。

血压定标:旋转三通开关旋钮，使血压换能器与大气相通(须注意三通开关方向，切勿将动脉血管与大气相通，以免动物大出血而影响实验，甚至导致动物死亡)，定标详细方法参见第四章第一节，三、(二)、2、( 3)、3)“定标和阈值控制”中［定标］“附:血压定标方法”，旋转三通开关旋钮，使血压换能器与动脉导管相通，调节周期检测阈值线，屏幕下方显示收缩压、舒张压、平均压和心率(心率由血压的搏动周期计算得到)。

单击“储存”按钮，程序开始储存信号(储存区上方的长条指示当前储存区中数据的长度)。再次单击“储存”按钮。储存终止。

单击“标记”按钮，曲线上方显示一箭头，用于表示某一处理。

单击“刺激”按钮，D/A口输出刺激脉冲。

单击“结束”按钮，退出“采集信号”功能，进入“浏览和测量”功能。

程序以500个数据作为一个记录进行浏览和测量。窗口下方的滑动条用来选取记录。拖动滑动块可指向任意一个记录;单击滑动条两端的箭头左移或右移一个记录;单击滑动块两旁的空白处可向前或向后搜索临近的标记，并跳转到有标记的记录，如搜索不到标记，则左移或右移一个记录。

单击“增大X轴时间”和“减小X轴时间”按钮，可压缩和展宽数据。

在原始信号和第二信息区按下鼠标左键并移动鼠标，屏幕上显示两个垂直的红色光标。第一个光标落在鼠标左键按下处，第二个光标跟着鼠标移动，第二个光标所在处的数据于窗口下方的状态栏上显示出来。释放鼠标左键后，屏幕右方显现两个光标间数据的最小值、最大值、平均值、峰-峰值和两个光标的时间间隔，这些数据被保存在汇总表中。

调用“文件/打印”功能，打印波形。

7．观察神经对血压和心率变化的调节

( 1)用动脉夹夹闭右侧颈总动脉，阻断血流15 s，观察血压和心率的变化。

( 2)将右侧降压神经置于保护电极上，以适当强度重复脉冲(一般取波宽0．1 ms，电压0．1～1 V，频率20 Hz，实验中可根据具体情况改变刺激参数，单击“刺激”输出刺激脉冲)。刺激该完整神经，观察血压和心率的变化。

( 3)刺激右颈迷走神经，观察血压和心率的变化。

8．观察传出神经系统药物对血压和心率变化的影响，按以下顺序从耳缘静脉给药:

( 1)生理盐水 　　 0．1 ml/kg。

( 2)阿托品　　　　1∶100，0．1 ml/kg，待血压平稳后依次给予以下药物。

( 3)肾上腺素　　　1∶10 000，0．1 ml/kg。

( 4)去甲肾上腺素　1∶10 000，0．1 ml/kg。

( 5)异丙肾上腺素　1∶10 000，0．1 ml/kg。

( 6)酚妥拉明　　　1∶1 000，0．4 ml/kg。注意是否出现血压下降，心率加速，呼吸及四肢运动兴奋现象。接着再重复( 4)，观察血压变化与前者有何不同。

( 7)普萘洛尔　　　1∶1 000，1 ml/kg，注射速度应缓慢，防止心脏受抑制。3 min后再重复( 5)，观察血压变化与前者有何不同。

【思考题】

1．肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素等药对血压、心率有何作用?作用原理如何?

2．应用酚妥拉明后分别应用肾上腺素、去甲肾上腺素和异丙肾上腺素血压反应有何变化?

3．应用普萘洛尔后再分别应用上述3种药，血压、心率又有何变化?为什么?

(刘俊　刘元元)

实验2．2　某些因素和药物对离体蛙心活动的影响

【目的】学习斯氏( Straub)离体蛙心灌流法，观察内环境中某些因素和药物对心脏收缩的影响。

【原理】心脏具有自律性，作为蛙心起搏点的静脉窦能按一定节律自动产生兴奋。离体蛙心在任氏液灌流的情况下可以较持久地维持其生理特性。人为地改变任氏液中的离子成分，或者加入某些药物，能明显地影响心脏的活动。

【动物】蟾蜍。

【药品与器材】任氏液，0．65%氯化钠溶液，3%氯化钙溶液，1%氯化钾溶液，1∶10 000肾上腺素溶液，1∶100 000乙酰胆碱溶液，3%乳酸溶液，2．5%碳酸氢钠溶液;蛙类手术器械，玻璃蛙心插管，铁支架，蛙心夹，张力换能器，SKY型生物信号处理系统。

【实验步骤】

1．离体蛙心制备

( 1)暴露心脏　毁损蟾蜍脑和脊髓(详见实验1．2)，将其仰卧位固定在蛙板上。用镊子提起胸骨后端腹部的皮肤，用粗剪刀剪一小口，然后由切口将剪刀伸入皮下，向左右两侧锁骨外侧方向剪开皮肤，并向头端掀开皮肤。用镊子提起胸骨后端的腹肌，在腹肌上剪一小口，将手术剪伸入胸腔内，紧贴胸壁(以免损伤下面的心脏和血管)，沿皮肤切口方向剪开肌肉，再用粗剪刀剪断左右鸟喙骨和锁骨，使创口呈一个倒三角形。用眼科镊提起心包膜，并用眼科剪将心包膜剪开，暴露心脏。

( 2)观察心脏的解剖　在腹面可以看到一个心室，其上方有两个心房。心室右上角连着一动脉干，动脉干根部膨大称为动脉圆锥，也称主动脉球。动脉向上分成左右两支。用玻璃分针从动脉干背面穿过，将心脏翻向头侧。在心脏背面两心房下端可看到颜色较紫红的膨大部分，为静脉窦。静脉窦是两栖动物心搏的起搏部位，它与后腔静脉相连。静脉窦与心房的交界处称窦房沟，而心房与心室的交界处称房室沟(图5- 2- 3)。

( 3)心脏插管　先用丝线分别结扎右主动脉、左右肺静脉、前后腔静脉，也可在心脏的下方绕一丝线，将上述血管一起结扎，但一起结扎时须特别小心，切勿损伤静脉窦而引起心脏停搏。所以结扎时，应用蛙心夹于心舒期夹住心尖，手提蛙心夹上连线将心脏轻轻提起，看清楚后再结扎，然后准备插管。在左主动脉下穿一丝线，打一松结，用眼科剪在左主动脉上向心剪一小斜口，让心腔内的血尽可能流出(以免插管后血液凝固)。用任氏液将流出的血冲洗干净后，把装有任氏液的蛙心插管插入左主动脉，插至主动脉球后稍稍退出，再将插管沿主动脉球后壁向心室中央方向插入，经主动脉瓣插入心室腔内。当插管内的液面随心搏上下移动时，说明插管已插入心室腔内。将预先打好的松结扎紧，并将线固定在插管壁上的玻璃小钩上。用滴管吸去插管中的液体，更换新鲜的任氏液，小心提起插管和心脏，看清在上述血管结扎线处的下方剪去血管和所有牵连的组织，将心脏摘出(图5- 2- 4)。

图5- 2- 3　蟾蜍心脏

2．固定支架　把蛙心插管固定在铁支架上，通过夹住心尖的蛙心夹及其连线，将心脏的舒缩活动所产生的张力变化传递给张力换能器。连线应保持垂直、松紧适当。实验装置见图5- 2- 4。

图5- 2- 4　实验装置

3．运行MFLab200．EXE选择“某些因素对离体蛙心的影响”，单击“确定”。

在菜单“功能选择”项下选择“采集信号”或直接单击工具条上的“采集信号”图标。启动采样后，屏幕中间为信号显示窗口。屏幕右边为实验控制面板。

通过实验控制面板设置实验参数和控制实验进程。X轴扫描时间根据需要设定。放大器通道控制参数设置请参见第四章第一节三、(二)、2、( 3)、5)“放大器控制”中的相关内容。

改变放大器增益，使信号幅度适中。

实验前作定标，方法:先将张力换能器悬空，单击“定标”按钮，稍后程序显示一个对话框，在对话框内选择“低值定标”，按“确定”。再悬挂10 g砝码，单击“定标”按钮，在对话框内选择“高值定标”，按“确定”，定标完毕。如不作定标，张力数值为相对值。

“储存”、“标记”、“浏览和测量”、“增大X轴时间”、“减小X轴时间”和“打印”等操作同实验2．1。

【观察指标】

1．描记正常心搏曲线。

2．将插管内任氏液全部吸出，换0．65%氯化钠溶液，描记心搏曲线，当曲线出现变化后即换新鲜任氏液使其恢复。

3．加入3%氯化钙溶液1～2滴，观察、换液同前。

4．加入1%氯化钾溶液1～2滴，观察、换液同前。

5．加入1∶10 000肾上腺素溶液1～2滴，观察、换液同前。

6．加入1∶100 000乙酰胆碱溶液1～2滴，观察、换液同前。

【补充项目】

1．加入3%乳酸溶液1～2滴，观察心搏变化，然后加入2．5%碳酸氢钠溶液1～2滴，观察其恢复过程，然后换液。

2．将插管内的任氏液全部换上40℃的任氏液，观察心搏曲线的变化，然后换室温任氏液待心搏曲线恢复。

3．将插管内的任氏液全部换上4℃的任氏液，观察、换液同前。

4．改变插管内液面的高度，观察记录同前。

【注意事项】

1．心室插管时不可硬插，以免戳穿心壁;摘出心脏时，勿损伤静脉窦。

2．每个实验观察的前、后都应用“清洁”的任氏液进行对照记录。

3．各种药液滴管要专用，不可混淆。每次加液的量不可过多，以刚能引起效应为度。每次滴药后最好用洗净的玻璃棒搅动几下，以免药液浮在上层，不易进入心脏。

4．除补充项目最后一项外，都要求插管内的液面保持相同的高度。

5．张力换能器钩挂端应稍稍向下倾斜，以免液体进入换能器。

6．随时用任氏液润湿蛙心。

【思考题】

1．用0．65%NaCl溶液灌注蛙心时，心跳有何变化?为什么?

2．高Ca2+任氏液与肾上腺素引起蛙心活动变化有何异同点?为什么?

(张　威)

实验2．3　心肌兴奋性的变化及蛙心起搏点的确定

【目的】学习记录在体蟾蜍心脏活动的描记方法，并通过观察记录期前收缩和代偿间歇，了解心肌兴奋性的特征;通过改变心脏不同部位的温度和结扎阻断窦-房或房-室兴奋传导，观察蛙心起搏点和心脏不同部位自律性的高低。

【原理】两栖动物心脏的起搏点位于静脉窦，此处的自动节律最高，心房和心室的细胞虽然也有自动节律性，但比较低，正常情况下服从静脉窦的节律。如果高位兴奋下传的途径受阻，则低位心肌细胞的自动节律性也能引起心脏的搏动。心肌的另一特性是其有效不应期特别长，约相当于心动周期的整个收缩期和舒张早期，在此期内给心肌以任何刺激，都不会引起反应;而在其后的相对不应期(约相当于心脏的舒张中期)给心肌一次阈上刺激，便可以在正常节律性兴奋到达心室之前，引起一次扩布性的兴奋和收缩，即“期前收缩”。而正常的节律性兴奋到达时，心肌正好处于期前收缩的有效不应期内，因此心室不发生反应，须待静脉窦传来下次兴奋才能发生反应，所以在期前收缩之后就会出现一个较长的舒张间歇期，即代偿间歇。

【动物】蟾蜍或蛙。

【药品与器材】任氏液;蛙类手术器械，张力换能器，刺激器，蛙心夹。

【实验步骤】

1．毁损脑与脊髓及暴露心脏(同实验1．1和2．2)。

2．用蛙心夹于舒张期夹住心尖，该蛙心夹通过一根细丝线与张力换能器的金属弹片相连，将心脏机械活动转换为电信号输入到SKY型生物信号处理系统(图5- 2-5)。

3．运行MFLab200．EXE系统，选择相应电脑实验程序。

图5- 2- 5　实验装置示意图

【观察项目】

1．期前收缩和代偿间歇

( 1)描记正常心搏曲线，测算心动周期时程，分清曲线的收缩相和舒张相。

( 2)选择一适当的刺激强度(约5 V，1ms)，分别在心室收缩期和舒张早期、中期、晚期对心室施加同样的电刺激，注意观察是否引起期前收缩和代偿间歇。

( 3)增加刺激强度，在心缩期给予心肌一次刺激，观察心肌曲线是否发生变化。

2．蛙心起搏点

( 1)观察心脏的解剖(同实验2．2)。

( 2)用眼科镊在主动脉干下穿一线备用，用玻璃分针将心尖翻向头端，暴露心脏背面，然后将预先穿入的线沿着半月形白色条纹的近心房侧迅速结扎，以阻断静脉窦和心房之间的传导，此为斯氏第一结扎。观察静脉窦、心房、心室的搏动情况。经过一段时间后，再记录心房、心室的搏动情况。

( 3)在心房和心室的交界处(房室沟)作第二次结扎，即斯氏第二结扎，观察心房、心室的搏动。经过一段时间后，再记录心室搏动。

【注意事项】

1．实验过程中经常用任氏液湿润心脏，以防干燥。

2．连接蛙心夹和张力换能器的线要垂直，且紧张度适当。

3．每刺激一次心室后，要让心脏恢复正常搏动后，再行下一次刺激。

4．结扎后如心房和心室停跳时间过长，可用玻璃钩给心房和心室一机械刺激，或加温处理，促进心房、心室恢复跳动。

【思考题】

1．代偿间歇是怎样产生的?期前收缩后一定出现代偿间歇吗?为什么?

2．两次斯氏结扎后，静脉窦、心房、心室的搏动频率有何不同?原理何在?

(张　威)

实验2．4　药物对哇巴因诱发豚鼠心律失常的保护作用

【目的】学习用哇巴因诱发豚鼠心律失常的方法，观察利多卡因对此种心律失常的保护作用。

【原理】哇巴因是广泛应用于实验室的强心苷类的标准工具药，它能抑制浦肯野纤维上的Na+－K+－ATP酶，使细胞内Na+、Ca2+大量增加，K+明显减少，促进细胞膜去极化，使心室肌自律性提高，引起室性心动过速或室颤。用此种模型筛试抗心律失常药时通常将供试品预先给予实验动物，再静脉注射哇巴因，以心律失常出现时间的延迟或动物对哇巴因耐量的增加作为有效指标。

【动物】豚鼠，300～400 g。

【药品与器材】20%乌拉坦、0．01%哇巴因，0．5%利多卡因，生理盐水;哺乳动物手术器械一套、蠕动泵、头皮针、注射器、SKY型生物信号处理系统。

【实验步骤】

1．取豚鼠2只，编号，称重。两鼠均用20%乌拉坦1．2g/kg腹腔注射麻醉，仰卧位固定在手术台上。

2．分离两侧颈外静脉，一侧插入与盛有0．01%哇巴因蠕动泵的输出端相连的头皮静脉注射针头，另一侧插入与注射器相连的头皮静脉注射针头，以备注射利多卡因。

3．手术完毕，将针形电极插入四肢皮下(注意切勿插入肌肉中)，按电极的颜色不同，连接方式为:红色——右前肢，黄色——左前肢，蓝色——左后肢，黑色——右后肢。电极另一端连接SKY型生物信号处理系统(图5- 2- 6)。

图5- 2- 6　仪器连接示意图

4．运行MFLab200．BE，选择“心律失常及其药物治疗”，单击“确定”。

放大器通道控制参数设置如下:

( 1)增量　视信号幅度而定。

( 2)低频滤波　0．16～1．6 Hz。

( 3)高频滤波　0．5～5 kHz。

观察、记录10个正常心电信号。

5．甲鼠静脉注射0．5%利多卡因5mg/kg，乙鼠静脉注射生理盐水1ml/100g。两鼠给药10min后，以5μg/min速度恒速灌注哇巴因(注意，灌注开始立即标记)，密切观察上述心电图指标的变化，描记出室性期前收缩及室颤的心电图变化。比较两只豚鼠诱发心律失常所需的时间，计算室早、室颤时哇巴因的剂量。

表5- 2- 1　利多卡因对哇巴因诱发豚鼠心律失常的保护作用

【思考题】

1．哇巴因对豚鼠心电图各项指标有何影响?

2．利多卡因对哇巴因所致的心律失常有何影响?

(汪慧菁　徐昕红)

实验2．5　在体兔心脏生理性调节及离子、药物的作用

【目的】

1．学习家兔开胸和心脏的暴露方法，初步掌握开胸后家兔在位心脏活动［心肌收缩力、心率、心电图( ECG)］的观察和描记方法。

2．观察应用CaCl2后，对心肌收缩力、心率、ECG的影响。

3．观察应用强心苷(毒毛花苷K)后，对上述指标的影响。

【原理】　钙离子是心肌兴奋-收缩偶联的关键物质，心脏钙通道的开放受电压调控。强心苷能选择性与细胞膜的强心苷受体结合，增加兴奋时心肌细胞内Ca2+含量。本实验须通过开胸，剪开心包膜，在体记录心肌收缩力、心率的变化。在胸膜不破坏的情况下可直接进行描记，不需用呼吸机。

【动物】　家兔，2．7 kg以上。

【药品与器材】1．5%戊巴比妥钠或20%乌拉坦溶液，生理盐水，0．08%肝素溶液，3% CaCl2溶液，毒毛花苷K(毒K) ;兔手术台，手术器械，咬骨钳，持针器，直、弯眼科剪，小拉钩( 2只)，蛙心夹，手术缝针，注射器( 2、5、10 ml)，动脉夹，头皮针，烧杯，纱布，张力换能器，SKY型生物信号处理系统，心电描记用针型电极，TKR- 200C型动物呼吸机。

【实验步骤】

1．仪器连接见图5- 2- 7。

图5- 2- 7　仪器连接示意图

2．取较大( 2．7 kg以上)家兔一只，用1．5%戊巴比妥钠溶液按30 mg/kg或20%乌拉坦溶液750～1 000 mg/kg，从耳缘静脉缓慢注射，待全身麻醉后，把家兔置于手术台上，仰卧，四肢及头部固定，剪去颈部被毛并从正中切开颈部皮肤，分离并切开气管，切口呈“⊥”形(切口应远离甲状腺部位，以免出血)，插入“Y”形气管套管，以粗线结扎固定，作呼吸通气用。“Y”形管的两端分别接橡皮管，其中一根橡皮管连接呼吸机(图4- 3- 7)并调节好呼吸机的各项参数，另一根橡皮管在使用呼吸机时将其夹闭。

3．剪去胸部被毛并沿胸骨中线自胸锁关节水平线至剑突上切开皮肤，暴露胸骨及肋软骨部位，小心分离肋间肌，结扎并剪断，沿胸骨的左缘剪断1～3肋软骨(慎勿触破胸壁内侧的内乳动脉)，用弯止血钳轻轻撑开胸腔切口，即见心包及搏动的心脏。

开胸后检查呼吸机工作是否正常，以确保呼吸正常、畅通。

用眼科剪剪开心包前部，使可清楚地看到心脏前部的结构，随时注意湿润心脏及保温。在心脏适度暴露后，即可进行直接描记。用蛙心夹夹住心尖搏动明显处，再连接张力换能器，观察并记录心收缩力、心率。此外，将心电导线(红、黄、黑)分别连接右、左上肢及右下肢，用以记录ECG曲线。

4．运行MFLab200．EXE。选择“在体兔心脏生理性调节及离子、药物的作用”，单击“确定”。

在菜单“功能选择”项下选择“采集信号”或直接单击工具条上的“采集信号”图标。启动采样后，屏幕中间为信号显示窗口。屏幕右边为实验控制面板。

通过实验控制面板设置实验参数和控制实验进程。X轴扫描时间根据需要设定。放大器通道控制参数设置请参见第四章第一节三、(二)、2、( 3)、5)中的相关内容。

改变放大器1增益，使心电信号幅度适中。

血压定标参见实验2．1。

“储存”、“标记”、“浏览和测量”、“增大X轴时间”、“减小X轴时间”和“打印”等操作同实验2．1(或参见第四章第一节)。

5．分离一侧股静脉，向心方向插入头皮针(塑料管事先装满生理盐水)，用动脉夹使之固定，以备给药。准备完毕后，缓缓开放动脉夹，描记正常心肌收缩力、心率、ECG曲线。随即依下列顺序，由股静脉注入各药。每次药物注射后需立即用1ml生理盐水将余药冲入血管内。在换接药液或生理盐水的注射器前，必须先用生理盐水滴满头皮针末端，以防止气泡注入。

每次给药前先记录正常心收缩力、心率及ECG，随后给药，记录药物作用最明显时的心收缩力、心率及ECG，待前面一个药物作用完全消失后，再给下面一个药物。

给药顺序:

1．生理盐水　　 　1 ml

2．CaCl2( 3%)　 0．5 ml/kg

3．毒毛花苷K　 　 每次1 mg

【注意事项】

1．固定心包膜于胸壁或心脏描记时，不要影响心脏的自然搏动，同时尽量避免干扰家兔的呼吸。

2．给予CaCl2必须观察一段时间后，再给毒毛花苷K。

结果填入下表:

【思考题】

根据实验结果详细分析毒毛花苷K的作用机制。

(韩桂珍)

实验2．6　家兔失血性休克

【目的】以血压为检测指标，通过人工急速、多次放血建立家兔失血性休克模型，观察失血前后及使用扩容和血管活性药物前后，血压、微循环、心率、呼吸频率等的变化，加深对休克病理生理的理解及相关药物的作用机制。

【原理】在短时间内发生一定量的失血，机体将会发生休克，一般是指在15 min内失血量超过总血量的20%就会引起休克。休克时因有效循环血量不足，组织灌流量明显减少而引起血压下降、微循环障碍等病理生理改变。

【动物】家兔。

【药品与器材】1．5%戊巴比妥钠溶液(或20%乌拉坦溶液)，0．08%肝素溶液，1%普鲁卡因溶液，3．8%枸橼酸钠溶液，生理盐水，治疗用药品( 1∶10 000去甲肾上腺素溶液)。手术器械一套，兔手术台，动脉夹，三通开关，气管插管，颈动脉插管，SKY- A4型生物信号处理系统，肠系膜观察装置，50、20、5、2、1ml注射器各一副，针头、结扎线、纱布等。

【实验步骤】

1．麻醉　取2．5～3．0 kg家兔一只，称重后从耳缘静脉慢速注射1．5%戊巴比妥钠溶液30 mg/kg，或20%乌拉坦750～1 000 mg/kg行全身麻醉。仰卧固定于兔手术台，剪去颈、腹部及一侧腹股沟兔毛。

2．运行MFLab200．EXE选择“休克病理生理学及治疗学”，在弹出的“新建数据文件”对话框中选中“通道1信号来源于通道2微分”复选框，单击“确定”。

在菜单“功能选择”项下选择“采集信号”或直接单击工具条上的“采集信号”图标。启动采样后，屏幕中间为信号显示窗口。屏幕右边为实验控制面板。

通过实验控制面板设置实验参数和控制实验进程。X轴扫描时间根据需要设定。

血压定标方法参见实验2．1，调节周期阈值线屏幕下方显示收缩压、舒张压、平均压、心率等参数。

3．手术(详细方法见第三章第五节二、手术)

( 1)气管插管术　沿颈正中部位作5～6 cm长的纵形切口，用血管钳、手术镊和玻璃分针逐层钝性分离皮下组织和肌层，暴露并游离气管，在其下放置一根结扎线，在甲状软骨下约1cm处的气管上剪一“⊥”形切口，插入“Y”形气管插管，再用线结扎固定。

( 2)颈动脉插管术　在气管的背外侧找到颈总动脉，细心地分离掉周围组织，游离出一段长3～4 cm的颈动脉，于远心端用线结扎，近心端用动脉夹夹闭，然后用眼科剪在颈动脉结扎线的近心侧2～3 mm处剪一小斜口，插入充满肝素的动脉导管并予固定，导管通过三通开关连接压力换能器，后者连接于SKY型生物信号处理系统(仪器连接见图5- 2- 8)。旋转三通开关旋钮，使血压换能器与动脉导管相通，调节周期检测阈值线，屏幕下方状态栏显示收缩压、舒张压、平均压和心率。

图5- 2- 8　仪器连接示意图

( 3)股动脉插管　选择放置显微镜这一侧的股动脉沿其走向平行作一长约4 cm的切口，切开皮肤后即可见行走于筋膜下的股动脉鞘，用钝性分离方法细心暴露股动脉(详见第三章第五节二、4项)，然后按颈动脉插管方法进行插管。此导管用作放血。

( 4)肠系膜观察术　于耻骨联合上缘至剑突连线的中点，上下各旁开2．5～3 cm处剪去局部手术部位的被毛，在此长5～6 cm的连线上沿腹白线作一正中切口，皮肤切开后，沿腹白线剪开腹肌，进入腹腔，注意止血。然后从腹腔中轻轻地找出阑尾(起定位作用)，移出阑尾通过筋膜相连的远端的一段小肠，此处小肠肠系膜长、脂肪少，便于观察。将肠系膜(透明部分)平铺于肠系膜灌流盒中的载物台上(事先在灌流盒中倒入39℃的生理盐水，水量以满过载物台为度，接通恒温灌流装置，要求灌流盒夹层中循环水的温度恒定在39℃)，盖上灌流盒盖(见下面灌流盒盖的使用方法)，打开光源，点击电脑屏幕上工具条中的显微镜小图标，打开视频观察窗，调节显微镜粗调，同时观察电脑屏幕的视频窗口，直至看清微循环血流为止。必要时调节显微镜载物台移动尺，找到更合适的微循环观察部位。如在一个视野中既有动脉又有静脉，再有动-静脉吻合支则更好。

【注】灌流盒盖的使用方法灌流盒盖的作用主要是起到对肠段的保温、保湿和固定作用。因此如不用盖子，肠段就会冷却、干涸而影响血流，如用生理盐水浸满肠子进行保温保湿，则肠段会因未加固定而漂浮移动，致使观察的部位及其结果前后不一致，因此使用盖子十分重要。盒盖的上方有一调节圈，中央的圆形凹形透明视窗是可以上下移动的，将调节圈顺时针转动，可使视窗向上移动，反之则向下移动，由此来调节视窗内面与灌流盒中载物台面之间的距离，以调节对肠系膜固定的松紧程度，使达到既能固定住肠系膜又不影响血流为度。同时需注意，视窗内面须刚好浸于水中，这样可避免在视窗内面产生水雾而影响视窗透明度，同时要设法排除气泡。

4．全身肝素化　上述各种手术完成后，耳缘静脉注射0．08%肝素溶液3 ml/kg，以防止造模过程中放血不畅，影响实验进程。

5．正常指标观察　上述过程完成后，待家兔平均动脉血压稳定于100 mmHg ( 13．3kPa)左右，即可进行下列各项指标的观察(程序中的“储存”、“标记”、“浏览和测量”、“增大X轴时间”、“减小X轴时间”和“打印”等操作同实验2．1)。

( 1)血压　注意记录正常和各次放血及各项处理的数据(在血压记录过程中保持“储存”呈红色开启状态，并注意在各项处理前、后做好标记)。

( 2)肠系膜微循环

a．流态:按照微血管内血液流动的形态区分:

0级　　　 线(带)状——能看到血液在流动，但看不清血细胞的形态。

Ⅰ级　　 粒(絮)状——能清楚地看到血细胞的形态。　　　　　　　

Ⅱ级　　 淤滞——血细胞停止不动或来回摆动。　　　　　　　　　

也可在电脑屏幕上读出流速的相对参数，方法:沿血液行走的路线，按住鼠标左键移动鼠标，沿血管画出一曲线，长短不限，以便于观察为度，松开鼠标左键，可见一白色圆点沿血管移动，调节视频窗口下部速度滑块，向右移动则圆点移动速度加快，向左移动则减慢，直至调节到圆点的移动速度与血细胞的流动速度一致为止，此时视频窗口上方的读数框中会出现一数值，此值无单位，为一细胞流动速度相对值，可用于前后对比。

b．管径:选定最佳的观察部位和血管(同一视野中有动、静脉，动-静脉吻合支和毛细血管)。在电脑屏幕上用鼠标对准被测量血管的一侧边缘，按住鼠标右键横贯血管拖至血管的另一侧边缘，松开鼠标右键，屏幕上即会弹出一对话框，显示当前血管的相对管径值(数值没有具体单位，为相对值，用作前后对照)。

【注】观察流态可选择较细的毛细血管，观察管径可选择较粗的肌性血管(小动脉或微动脉)。

c．血管周围情况:有无血管轮廓模糊(有则表示液体渗出)或血细胞渗出。

( 3)呼吸频率及幅度(观察家兔腹部的起伏情况)。

( 4)一般情况观察　皮肤黏膜色泽、皮温、肛温、心率(调节红色阈值线，使其穿过每一个血压或dp/dt的波峰可正确记录心率)等。

6．造模(股动脉放血)　用50ml注射器，预先抽入3．8%枸橼酸钠溶液1．5～2 ml，然后通过股动脉导管急速、反复多次放血，待血压明显下降后暂停放血;放血停止后血压会逐步回升，此时可再次放血，使血压再度明显下降。经过3～4次放血，使血压维持在40 mmHg( 5．3kPa)左右。如血压过低可回输一些血液，一般总放血量为全血量的30%～40%。

7．每次放血操作的前后，均需观察上述各项指标，并作记录(注意在电脑记录曲线上作标记)。

8．实验性治疗　实验室内各组分成两部分:一部分组用去甲肾上腺素( 1∶10 000，0．1ml/kg，iv)进行处理，另一部分组用扩容方法(即回输血液，注意血液必须保持干净，如输血未达到治疗效果可补充生理盐水)进行治疗，比较两种处理的效果。学生也可根据所学的药理(传出神经药)和病理生理学知识，自行设计治疗方案(可参照实验2．1步骤8项中的血管活性药的用法、用量，所用药品应提前通知实验室老师，以便准备)。

9．在治疗前后重复观察和记录上述各项指标。

【注意事项】

1．插管的颈动脉与股动脉最好在同一侧，以利于后面实验操作。

2．动脉插管时应注意区分动静脉，动脉较细，色淡红或鲜红，有搏动。

3．股动脉放血时要防止动脉插管滑脱。

4．手术操作时应动作轻柔，取出小肠时应减少牵拉和对肠襻的刺激，以免引起反射性血压下降。

5．观察时应取肠系膜较长、脂肪较少的回盲部肠襻，以免系膜牵拉过度影响血流。同时应做好肠襻的保温。

6．每次放血后及时用肝素溶液或生理盐水驱尽导管内血液，以防凝血。

【思考题】

1．所记录的平均动脉血压变化呈何形态?试述其形成的病理生理机制。

2．实验中观察到失血前后的肠系膜微循环有何变化?试述其发生的病理生理机制。

3．实验性治疗后是否达到预期效果?你认为用哪种方法更合适?为什么?

(杨轶群)

实验2．7　家兔高钾血症

【目的】

1．学习家兔高钾血症模型的复制方法。

2．观察家兔高钾血症时心电图的变化。

3．了解高钾血症的抢救措施。

4．通过对实验结果的观察和分析，加深理解高血钾对心脏电生理的影响。

【原理】血钾浓度升高可对心肌细胞产生毒性作用，干扰正常心肌细胞的电生理活动，引发多种心律失常，尤其是心室纤颤和心搏骤停。本实验通过静脉输入氯化钾，造成家兔高钾血症，诱发心律失常，然后再给予葡萄糖酸钙进行抢救。

【动物】家兔，体重2～2．5 kg。

【药品与器材】1．5%戊巴比妥钠或20%乌拉坦溶液，4%氯化钾溶液，10%葡萄糖酸钙溶液，兔手术台，手术器械一套，20、10、5 ml注射器，5 ml刻度吸管，洗耳球，50 μl移液器，10 ml刻度离心管4支，10 ml玻璃试管4支，头皮针，输液装置一套，动脉插管两根，PF- 640型火焰光度计，SKY型生物信号处理系统，心电针型电极。

【实验步骤】

1．称重、麻醉和固定动物　家兔称重后，用1．5%戊巴比妥钠30 mg/kg或20%乌拉坦溶液1 g/kg从耳缘静脉缓慢注入。待麻醉后仰卧位固定。

2．气管、颈动脉插管　颈前部剪毛，颈前正中垂直切口，分离出一侧颈总动脉，作气管插管及颈动脉插管，分别结扎固定(详细步骤见第三章第五节二、手术)。

3．采血并制备血清　由颈动脉插管放血约2 ml至离心管中，编号，静置片刻使其凝固(天冷可置于37℃水浴或恒温箱中促其凝固)，待离心制备血清。

4．仪器连接　同实验2．4。

5．心电图描　记将心电针型电极分别插入四肢踝部皮下(避免刺入肌肉内，针型电极刺入部位要对称，导线避免纵横交错，实验台上液体要及时排除)，导联线按右前肢(红)、左前肢(黄)、左后肢(蓝)、右后肢(黑)的顺序连接。电极另一端连接SKY型生物信号处理系统。运行MFLab200．EXE程序，选择“心律失常及其药物治疗”软件包，单击“确定”。

在菜单“功能选择”项下选择“采集信号”或直接单击工具条上的“采集信号”图标。启动采样后，屏幕中间为信号显示窗口。屏幕右边为实验控制面板。通过实验控制面板设置实验参数和控制实验进程(放大器通道控制参数设置参见实验2．4)。X轴扫描时间根据需要设定。

改变放大器1增益，使信号幅度适中。调用菜单“文件/改变实验设置”功能，在相应对话框中输入放大器1的增益。“储存”、“标记”、“浏览和测量”、“增大X轴时间”、“减小X轴时间”和“打印”等操作同实验2．4。

以Ⅱ导联描记一段正常心电图。

6．复制高钾血症模型

( 1)滴注氯化钾溶液　用4%氯化钾溶液从耳缘静脉滴注，滴速控制在1．5～1．8 ml/min( 50～60滴/分钟，可采用蠕动泵进行恒速注射)，同时在另一侧耳缘静脉插入注射针头随时准备推注葡萄糖酸钙溶液。观察心电图的变化，出现P波低平增宽、QRS波群压低变宽和T波高尖后，停止滴注氯化钾溶液。按步骤3方法采集第二次血标本，静置待其凝固后离心。

( 2)严重心律失常及其抢救　恢复窦性心律后，静脉推注4%氯化钾溶液2 ml，监测心电图的变化。出现室颤或室扑时，立即停止推注氯化钾溶液，改为10%葡萄糖酸钙溶液静脉推注。如恢复窦性心律则表明抢救成功。按步骤3方法采集第三次血标本，静置待其凝固后离心。

( 3)致死作用观察　打开家兔胸腔(方法见实验2．5)，看到心脏搏动后，迅速静脉推注4%氯化钾溶液(约10 ml/kg)，观察心搏变化直至停搏(看清心脏停止在收缩期还是舒张期)。用注射器从心脏抽血，如血液不凝固，则直接离心取上清液测K+含量。

7．血清钾浓度测定　将所得的4支凝固血样离心管平衡，3 000 r/min，离心10 min。各取上层血清50 μl，吹入装有4．95 ml蒸馏水的玻璃试管中(稀释100 倍)，充分混匀(可用振荡器)，送火焰光度计检测血清钾浓度。火焰光度计的读数即血清K+浓度( mmol/L)。

【注意事项】

1．注意静脉滴注氯化钾溶液的速度，防止滴速过快，导致动物突发室颤而死亡。

2．滴注氯化钾时可先用生理盐水进行静脉预注射，以确认静脉通路通畅，并调节好滴速，再换氯化钾滴注。

3．动物对氯化钾的耐受性有个体差异，故在滴注过程中应密切观察动物心电图改变，当出现严重心律失常时立刻终止滴注。

4．实验台上的液体要及时清除。导线避免纵横交错。

5．针型电极插入部位要对称，并且注意插在皮下，切勿插入肌肉中。

6．凝固的血液不可放置过久(尤其在温度较高的环境)，血液凝固后可置于较冷的环境中备用。

7．在描记存储心电图曲线的过程中，注意及时标记所作的各种处理。

【思考题】

1．高钾血症对心脏的毒性作用是什么?

2．本实验中可观察到哪些心电图改变?发生机制是什么?

3．葡萄糖酸钙抢救高钾血症的理论根据是什么?还有其他的抢救方法吗?理论依据是什么?

(杨轶群)

实验2．8　家兔实验性缺血-再灌注损伤

【目的】通过关闭与开放家兔肠系膜上动脉的方法建立缺血-再灌注损伤模型，测定血清(或血浆)脂质过氧化物的代谢产物丙二醛( Maleic Dialdehyde，MDA)含量和自由基清除系统中的过氧化氢酶( Catalase，CAT)活力，以此来反映机体自由基在缺血-再灌注中的作用，以加深对所学理论的理解。

【原理】缺血可引起组织损伤，恢复血供是缓解组织损伤的有效措施。然而在某些情况下，恢复血供反而会使损伤进一步加重，这就称为缺血-再灌注损伤。其主要发生机制为自由基作用、细胞钙超载、微血管损伤和白细胞作用等。

【动物】家兔，2．0～2．5 kg。

【药品与器材】1．5%戊巴比妥钠溶液(或20%乌拉坦溶液)，1%普鲁卡因溶液，3．8%枸橼酸钠溶液，0．08%肝素溶液，甲醇，0．9%氯化钠溶液，双蒸水，丙二醛测定试剂(标准品、无水乙醇、混合试剂)，过氧化氢酶测定试剂(底物溶液) ;兔手术台，手术器械，手术灯，动脉夹2只，气管插管，塑料动脉导管，电热恒温水浴箱，沸水锅，台式离心机，混匀器，752分光光度计，石英比色怀，10 ml刻度离心管5支，试管，滴管，秒表，移液器( 20、100 μl)，5 ml刻度吸管，洗耳球，乳胶滴头，纱布，棉花。

【实验步骤】

1．取正常家兔，称重后用1．5%戊巴比妥钠溶液30 mg/kg，或20%乌拉坦溶液750～1 000 mg/kg经耳缘静脉缓慢注射，麻醉后仰卧固定，颈部及腹部剪毛。

2．行气管插管和颈动脉插管术(详见第三章第五节二、手术)。

3．自剑突下1．5 cm起向下沿腹白线做长约5 cm切口，打开腹腔，用温盐水纱布将内脏轻轻推向腹腔右侧(也可在切口右侧腹部垫以温盐水纱布，将肠子暂时翻出置于其上)，在看到腹膜后的脊柱及左侧肾脏后，找到位于左肾右上方(离左肾1～2 cm)贴近脊柱左侧的呈淡黄色的左肾上腺(如黄豆般大)，于左肾上腺右上方可见横向行走在肠系膜中的肠系膜上动脉(用手触摸有搏动感和绷紧感，用手指伸向肠系膜的另一面，在两面用手指捏住动脉，如有搏动感即可确认是肠系膜上动脉)，用血管钳或玻璃分针小心剥离周围组织，穿线备用。

4．耳缘静脉注入0．08%肝素溶液( 3 ml/kg)，作全身肝素化。

5．自颈总动脉取血2 ml(用3．8%枸橼酸钠按1∶9抗凝，反复颠倒混匀;如制备血清则不加抗凝剂，让其静置自然凝固)。

6．轻轻提起事先穿在肠系膜上动脉下的线段，用动脉夹夹闭血管，记录时间，将肠襻回纳腹腔，用止血钳夹闭腹壁切口，上面覆盖生理盐水纱布，以保温和防止水分蒸发。

7．分别于夹闭肠系膜上动脉30 min和60 min时各取血2 ml(处理同步骤5)。

8．夹闭60 min后松夹恢复血流，再于松夹起30 min和60 min时各取血2 ml(处理同步骤5)。

9．各血样品以3 000～3 500 r/min，离心10 min，取血浆(或血清)备用。

【测定指标及方法】

1．过氧化氢酶( CAT)测试

( 1)操作(表5- 2- 2)

表5- 2- 2　过氧化氢酶测定(可见光法，南京建成试剂盒)

混匀，0．5 cm光径，405 nm波长，以蒸馏水调零，测定各管吸光度。

( 2)酶活力计算　每毫升血清或血浆每分钟分解1 μmol H2O2的量为一个活力单位。

【注】* 271为斜率的倒数。

2．丙二醛( MDA)测试

( 1)按表5- 2- 3给各管加入相应试剂

表5- 2- 3　丙二醛测试方法(南京建成试剂盒)

( 2)各管经混匀器充分振荡混匀，管口用插有注射针头的翻口橡皮塞盖住(以防水分蒸发)，置95℃水浴(或开盖沸水浴) 40 min，取出后自来水流水冷却，3 500～4 000 r/min，离心10 min(或3 000～3 500 r/min，离心15 min)。

( 3)用玻璃滴管吸取上清液＊＊至1 cm光径玻璃比色皿，选532 nm波长，以蒸馏水调零，测吸光值。

( 4)计算

【注】*测定空白管可省略不做，用标准空白管代替;
＊＊吸取上清时用移液管吸取而不要倾倒，以免将沉淀倒入比色皿中影响测定结果。

【注意事项】

1．手术时避免出血，采血时不要将动脉夹移开，采血后立即夹闭。

2．每次加样前比色皿要用双蒸水冲洗2～3次，比色皿透光面要用擦镜纸擦干净。

3．加样必须准确，否则会影响结果数据的可靠性和可比性。

4．测CAT含量时，1 min间隔时间要准确，且各样品要保持一致。

5．标准管、标准空白管每批只需做1～2只。

6．若检测样品吸光度太低，可将水浴时间40 min延长至80 min，但前后操作应一致。

7．如果使用不同试剂盒则需按照其试剂盒说明书操作。

【思考题】

1．夹闭肠系膜上动脉后所测定指标发生了什么变化?为什么?

2．你得到的实验结果是否理想?如果不理想，其原因是什么?

(杨轶群)

实验2．9　左心室内压分析

【目的】学习心导管插管术及利用计算机进行左心室内压分析的方法。

【原理】左心室内压的变化，能直接反映心泵功能的情况。左心室内压经计算机处理，求出心动周期中左心室内压( LVP)的压力变化率( dp/dt)、心肌收缩成分缩短速度( Vpm，Vmax)及心力环面积等19项参数，通过对这些参数的综合分析，可用以评判左心室泵血功能。

【动物】家兔。

【药品与器材】20%氨基甲酸乙酯溶液，0．1%肝素溶液，1∶100 000肾上腺素溶液，1∶100 000去甲肾上腺素溶液，普萘洛尔。哺乳动物手术器械一套，SKY型生物信号处理系统，1 m长橡皮管一根。

【实验步骤】

1．动物称重、麻醉及气管插管等基本操作技术见“第三章第五节，二、手术”。

2．分离右侧颈总动脉鞘，游离出右侧颈总动脉长3～5 cm，在该动脉下穿两根线，一根在尽可能靠近头端处将动脉结扎;另一根留作固定心导管用。用动脉夹在尽可能靠近心脏端处夹闭总动脉，然后用眼科剪刀在头端结扎处下约0．3 cm的动脉壁上剪一个半斜切口，准备插心导管用。

3．心导管与血压换能器相连，并用肝素溶液充灌心导管，排除心导管与血压换能器中的气泡，备用。

4．插入心导管　于家兔左胸前触摸到心尖搏动最明显处，测量此点到右侧颈总动脉切口的距离，并将该段距离标记在塑料导管上，以便掌握导管推进的最大深度。

将充满肝素溶液的心导管经右侧颈总动脉切口插入动脉腔内，直至动脉夹处，将备用线打一松结。然后用左手拇指和示指捏住动脉和插在里面的导管，右手慢慢放开动脉夹，如有血液由切口流出，可再次夹住动脉夹并将松结稍稍扣紧，再放开动脉夹。放开动脉夹后，立即将导管缓缓向动脉腔内推进。推进导管时，应根据动脉走向而改变推进的方向和力度，以防止导管刺破动脉壁而造成动物死亡。

插管时，速度应尽可能缓慢，用力应适度，当推进阻力较大时，可采用退退进进，不断改变方向的办法插入。插管时，应密切注视计算机屏幕上显示的血压波形，以判断导管所处的位置与状态。

根据塑料导管上的距离标记可估计导管离左心室的距离，一般情况下，当导管尖端进入主动脉瓣入口处时，有明显的抵触、抖动感，此时稍加用力，突然产生一个突破感时，即表示导管已进入左心室内，计算机屏幕上所显示的波形会有明显变化(舒张压下降到－2～1 mmHg)

用备用线结扎心导管，并将心导管固定于近旁活动度较小的组织上或气管插管上。

5．实验装置连接见图5- 2- 9。

图5- 2- 9　实验装置连接

6．程序操作　主要步骤如下。

( 1)信号采集　进入采样界面，通过实验控制面板完成对放大器参数的设置和实验过程的控制。

a．放大器参数设置

( a)心电

低频滤波: 0．16～1．6 Hz;高频滤波: 0．5～5 kHz。

增益: 1 000～8 000倍。

( b)心室内压

低频滤波: DC;高频滤波: 0．5～5 kHz。

增益: 100～200倍。

b．心室内压定标

详细方法参见第四章第一节三、(二)、2、( 3)、3)“定标和阈值控制”中的［定标］附:血压定标方法

c．信号采集和标记

按“储存”按钮，将需要的信号储存下来。“储存”按钮是一个开关，按一下“储存”开启，再按一下“储存”关闭。

标记编辑框内可输入标记字符，在“储存”开启的情况下，单击“标记”按钮，标记字符就被记忆。

( 2)心功能分析　在信号浏览界面，移动屏幕下方滑动条，显示要分析的信号区段。

在主菜单中选择“功能选择/计算和分析/双信息图”，程序分析当前屏幕所显示的信号，自动判断周期，并显示心力环、收缩速度环和有关参数。

程序报告的参数如下:

HR　　　　　　　　　　　 心率

Cycle　　　　　　　　　　心动周期

EDP　　 　　　　　　　　舒张末期室内压

Peak　　 　　　　　　　　室内压最大值

Peak time　　　　　　　　室内压最大值所在时间

dp/dt max　　　　　　　 室内压上升段最大变化率

dp/dt max time　　　　　 室内压上升段最大变化率所在时间

－dp/dt max　　　　　　 室内压下降段最大变化率

－dp/dt max time　　　　 室内压下降段最大变化率所在时间

IP　　　　　　　　　　 等容收缩期室内压

dp/dt max/IP　　　　　　 等容收缩期最大变化率与室内压之比

Vce40　　　　　　　　　 室内压为40 mmHg( 5．3 kPa)时的心肌纤维缩短速度

Vpm　　　　　　　　　　 心肌纤维缩短速度最大值(生理值)

Vmax　　　　　　　　　 心肌纤维缩短速度最大值(理论值)

L0　　　　　　　　　　 心力环总面积

L1～L4　　　　　　　　　 心力环四部分面积

L0、L1～L4的单位为CFU，1 CFU = 10 000 mmHg2/s。

图5- 2- 10为心肌力学分析主要参数的图解。( A)心室内压信号的一个周期; ( B)为心力环; ( C)为心肌纤维缩短速度环。

图5- 2- 10　心肌力学分析主要参数图解

其他操作详见第四章第一节第三部分“MFLab200功能学科实验软件包”使用说明。

【观察项目】

1．记录静息状态下家兔左心室压力曲线，并求得心泵功能的各项参数，作为前对照。

2．于耳缘静脉注入1∶10 000肾上腺素溶液0．2～0．5 ml，观察心泵功能变化。

3．静脉注射1∶10 000去甲肾上腺素溶液0．2～0．5 ml，观察心泵功能变化。

4．长管窒息时心泵功能变化。

5．静脉注射普萘洛尔0．3 ml后，观察心泵功能的变化。

【注意事项】

各观察项目之间，需使动物休息足够时间，并作好前、后对照。

(曹银祥)

实验2．10　急性右心衰竭

【目的】

1．通过右心室前、后负荷的急剧过度增加，复制家兔急性右心衰竭动物模型。

2．观察急性右心衰竭时血流动力学的主要改变及心力衰竭的常见症状、体征。

3．加深对急性右心衰竭发病机制及机体的代偿措施的理解。

【原理】通过耳缘静脉注射液状石蜡(栓塞剂)致急性部分肺小血管栓塞，造成右心后负荷增加;通过大剂量快速静脉输液增加右心前负荷。由于右心前、后负荷的急剧过度增加，造成右心室收缩和舒张功能降低，而导致家兔急性右心衰竭。

【动物】家兔，体重2．5 kg。

【药品与器材】1．5%戊巴比妥钠溶液(或20%乌拉坦溶液)，1．0%普鲁卡因溶液，0．08%肝素溶液，液状石蜡，洛贝林(山梗菜碱) ;手术器械一套，1、5、10 ml注射器，SKY型生物信号处理系统，中心静脉压测量装置，输液装置，听诊器，秒表。

【实验步骤】

1．家兔称重后，由耳缘静脉注入1．5%戊巴比妥钠溶液30 mg/kg，或20%乌拉坦溶液750～1 000 mg/kg麻醉，仰卧位固定于兔台上。

2．颈部正中皮下注射1．0%普鲁卡因局部麻醉，做颈部正中切口，按常规手术操作分离气管并插管后，游离出两侧颈外静脉和一侧颈总动脉。

3．由耳缘静脉注入0．08%肝素溶液3 ml/kg，经右侧颈外静脉插入中心静脉压导管，测量中心静脉压( CVP) ;经左侧颈外静脉插管连接输液装置;经颈总动脉插管连接SKY型生物信号处理系统描记动脉血压(血压测定方法参见实验2．1) ;于剑突部位皮下穿一大头针，用棉线将大头针与张力换能器连接，调节张力换能器高度，使棉线适度拉紧，家兔胸廓的运动由张力换能器换能后输入计算机记录，也可用记录膈肌放电的方法来描记呼吸。

4．手术操作完成后，稳定5 min，观察指标为:动脉血压、心率、心音强度、呼吸(并听诊胸背部有无水泡音)、中心静脉压、循环时间测定(自耳缘静脉快速注入0．3%洛贝林1．0 ml，计由注入至出现呼吸变深变快的时间)、肝-中心静脉压反流试验(以压迫上腹3 s内测得中心静脉压上升的水柱厘米数表示)。

5．实验过程

( 1)实验前各项指标观察完毕后，即由耳缘静脉注入液状石蜡( 0．5 ml/kg)。注射速度要慢，1～2 min注完。注射时注意观察呼吸、血压(注射血压下降至70 mmHg为度)和中心静脉压，当有一项指标出现明显变化时，即停止注入，并记录上述各项指标的变化。观察10 min后再次测量上述各项指标。

( 2)待动物血压、呼吸稳定后，以每分钟5 ml/kg的输液速度( 180～200滴/ 分)快速输入生理盐水，输液量每增加25 ml/kg(即每5 min)测定上述各项指标一次，直至动物死亡。

( 3)动物死亡后，挤压胸壁，观察气管内有无分泌物溢出，剖开胸、腹腔，观察有无腹水及其量、肠系膜血管充盈情况、肠壁有无水肿、肝脏体积和外观变化;观察心脏(右心)体积变化和有无胸水、肺脏外观及切面变化。最后剪破静脉，放出血液，注意肝脏和心脏体积变化。

【注意事项】

1．静脉导管的插入深度为5～7 cm，在插管过程中如遇阻力，可将导管稍微退出，调整方向后再插，切忌硬插，以免刺破血管。插好后可见中心静脉压随呼吸明显波动。

2．用液状石蜡注射要事先将液状石蜡和注射器加热到37℃，以降低液状石蜡黏稠度，使其在进入血液后易形成小栓子。

3．栓塞剂注入速度宜慢，出现血压明显降低时应立即停止注射，否则可导致动物肺梗死而立即死亡。

4．若输液量已超过200 ml/kg，而各项指标变化仍不显著时，可再补充注入栓塞剂。

5．尸检时注意不要损伤胸、腹腔血管，以免影响对胸腹水的观察。

【思考题】

1．本实验中引起右心衰竭的机制是什么?哪些指标变化是右心衰竭所致?

2．本实验动物存在哪些类型的缺氧?其发生机制是什么?

3．实验动物是否发生了酸碱平衡紊乱、肺水肿和心源性休克?如果是，其发生机制如何?

4．循环时间测定和肝-中心静脉压反流实验说明了什么问题?

(吕　雷)

第三节　呼吸系统实验

实验3．1　呼吸调节及药物影响

【目的】学习哺乳动物的气管插管术和记录呼吸运动的方法;观察吸入气中PO2降低、PCO2升高、血液中pH值降低等化学性刺激，支气管和细支气管的机械性牵张刺激，以及药物和其他各种刺激对家兔呼吸运动的影响。

【原理】呼吸运动具有节律性，这种节律性活动主要来源于延髓及脑桥，也受体内外各种因素的影响。呼吸中枢可接受多种感受器的传入冲动，如化学感受性反射、肺牵张反射和呼吸肌本体感受性反射等，通过这些反射，影响呼吸运动。动脉血液中PO2降低、PCO2增高和pH值降低可通过化学感受性反射使呼吸运动加深加快;扩张肺时，对支气管和细支气管的机械性牵张刺激可通过肺扩张反射使吸气及时终止而向呼气转换;萎陷肺时可通过肺萎陷反射兴奋吸气。这两个反射弧的传入神经纤维都走行在迷走神经中。呼吸兴奋、抑制药物可以通过不同途径影响呼吸运动。

本实验运用记录膈肌放电的方法，通过记录膈肌(最主要的呼吸肌)放电频率来反映吸气中枢的兴奋状态。原始信号(膈肌放电)通过触发积分得到积分曲线，积分曲线的波宽和波幅可以分别反映呼吸运动的快慢和强弱变化。

【动物】家兔。

【药品与器材】哺乳动物手术器械，空气球胆，氮气和二氧化碳气体供气系统。0．5～1 m长的橡皮管，不锈钢插入式引导电极，SMUP- PC型生物信号处理系统，1．5%戊巴比妥钠溶液(或20%乌拉坦溶液)，0．1%肝素溶液，3%乳酸溶液，生理盐水，1%吗啡溶液，10%尼可刹米溶液。

【实验步骤】

1．称重、麻醉、固定及气管插管(方法见实验2．1)。

2．分离两侧颈迷走神经，穿线备用。

3．膈肌暴露手术　剪去胸腹部交界处手术部位兔毛，摸到剑突后，在其表面沿正中线纵行切开皮肤2～3 cm，用止血钳分离皮下组织及腹壁肌，暴露剑突。将剑突上方狭窄部软骨剪一缺口，并将剑突向上翻起缝合于皮肤上，即暴露出剑突背侧的膈肌。将两根不锈钢引导电极平行的插入暴露的膈肌片内，实验过程中电极需固定良好，勿使其摆动(用胶布固定在手术台上)。动物妥善接地。

4．按图5- 3- 1连接实验装置，信号由通道1输入。生物电放大器的低频滤波设置为1．6 Hz或16 Hz，高频滤波设置为5 kHz或50 kHz。

图5- 3- 1　仪器连接示意图

5．运行MFLab200．EXE。选择“呼吸调节及药物影响”，单击“确定”。

在菜单“功能选择”项下选择“采集信号”或直接单击工具条上的“采集信号”图标。启动采样后，屏幕中间为信号显示窗口。屏幕右边为实验控制面板。

通过实验控制面板设置实验参数和控制实验进程。X轴扫描时间、Y轴坐标根据需要设定。

根据屏幕上显示的信号，适当调节生物电放大器的位移和增益。单击“阈值↑↓”按钮，使阈值线刚好落在噪声之上，程序以此水平线作参考，将膈肌放电有效检出(膈肌放电触发积分原理见图5- 3- 2)。阈值线放置一定要适宜，否则积分无法出现。积分曲线的幅度可用相应按钮放大或缩小。如发现积分曲线与原始信号不同步，可调用菜单“文件/改变实验设置”功能，适当加大“等待时间”(初始值为40．00 ms)。

图5- 3- 2　膈肌放电触发积分原理

( a)膈肌放电和积分曲线上线:膈肌放电下线:积分曲线

( b)触发积分原理A、B、C、D为脉冲检出点，T0为等待时间(预设)。

当相邻两脉冲检出点之间的时间间隔＜T0，积分继续;间隔时间＞T0，积分结束。

如图所示，积分从A点开始。T1和T2＜等待时间T0，积分继续; T3＞T0，积分在E点结束( CE =T0)。

“储存”、“标记”、“浏览和测量”、“增大X轴时间”、“减小X轴时间”和“打印”等操作同实验2．1。

【观察项目】

1．吸入空气　将装有空气的球胆导管置于一水瓶的液面下，调节球胆导管上螺丝夹，使气流量和流速维持在每秒1～2个气泡。将球胆导管套在气管插管上，气管插管的另一侧管用手指轻轻捂住，观察并记录膈肌放电和积分曲线，以此为对照。

2．吸入氮气　打开墙上供气系统氮气开关，按上述空气流量调节氮气流量，以同样的气流量和流速使动物吸入氮气，观察并记录膈肌放电和积分曲线。

3．吸入二氧化碳气体　打开墙上供气系统二氧化碳气体开关，以上述同样方法，同样的气流量和流速使动物吸入二氧化碳气体，观察并记录膈肌放电和积分曲线。

4．肺牵张反射

( 1)于“Y”形气管插管的两个外侧管上分别接上约5 cm长的橡皮管一段，其中一侧借细橡皮管连接50 ml注射器，另一侧为以后夹闭备用。实验前先记录一段对照曲线，然后看准吸气相之末，先将“Y”形气管插管未连接注射器的一侧夹闭，随即在连接注射器的一侧将注射器内事先抽好的空气( 20～30 ml)迅速注入肺内，并使肺维持在扩张状态直至看到膈肌放电积分曲线发生变化(注射器此时不抽出)，观察并记录膈肌放电变化。然后撤除夹闭，观察膈肌放电恢复过程。休息片刻，待膈肌放电平稳后，于呼气相之末，夹闭气管插管一侧分支，随即在另一侧通过注射器从肺内迅速抽气( 20～30 ml)，使肺维持在萎陷状态直至看到膈肌放电积分曲线发生变化，观察并记录膈肌放电变化。然后撤除夹闭。以上观察可反复进行几次。

( 2)待膈肌放电恢复平稳后，先切断一侧颈迷走神经，观察并记录膈肌放电变化;再切断另一侧，记录并比较切断双侧迷走神经前、后的膈肌放电及呼吸频率和深度的变化。

( 3)在切断迷走神经后，重复上述向肺内注气和从肺内抽气实验，观察并记录膈肌放电变化。

5．观察药物的影响

( 1)耳缘静脉注射生理盐水1 ml/kg，观察并记录膈肌放电变化。

( 2)耳缘静脉注射3%乳酸溶液1～2 ml/kg，观察并记录膈肌放电变化。

( 3)耳缘静脉注射1%吗啡溶液0．5 ml/kg，观察并记录膈肌放电变化(老年动物的效应可能较青壮年动物为差)。

( 4)耳缘静脉注射10%尼可刹米1 ml/kg(慢推)，观察并记录膈肌放电变化。

【注意事项】

1．暴露膈肌时，切口不可太上，勿损伤胸壁。腹部切口也不宜过大，以免呼吸运动影响记录膈肌放电(基线不平)。剑突中线两侧肌肉内血管丰富，游离过程中尽量减少出血。

2．插肌电引导电极时，不可插向深面，以防气胸。引导电极应尽量一次插成，以免反复插造成血肿和肌损伤而影响肌电引导。电极需固定牢固，避免实验过程中脱落。

3．吸入气流量和流速不宜过大，每项观察时间不宜过长，出现效应后即应停止。气体流速在不同观察项目中应保持一致。气管插管的另一侧管不夹闭(做肺牵张反射时应夹闭)。

4．呼吸抑制时解救要及时，如呼吸抑制过深，动物易死亡。

5．进行“肺牵张反射”观察项目时，抽气和注气要注意充分配合。确保在吸气末打气、呼气末抽气。

6．等待时间( T0)设置要恰当，T0值过大造成连续积分，T0值过小造成一次吸气过程中积分中断。

7．注射乳酸时切忌误入皮下，造成家兔挣扎。

8．吗啡抑制呼吸后，尼可刹米解救须及时，但注射速度不宜过快(防止惊厥)。

【思考题】

1．吸入二氧化碳气体和吸入氮气后引起的呼吸变化有何不同?机制如何?

2．切断迷走神经后，重复吸入气体，与迷走神经完整时有无区别?为什么?

(王铭洁)

实验3．2　缺氧

【目的】通过在小鼠复制乏氧性、血液性和组织性缺氧，观察小鼠在缺氧时呼吸深度、皮肤黏膜、血液颜色和活动情况的改变，并通过这些指标的改变来分析各种类型缺氧的发生原因和病理生理变化。

【原理】小鼠在密闭的环境中因消耗氧气会造成所在环境中吸入气的氧浓度下降，引起乏氧性缺氧;如小鼠吸入气中一氧化碳含量增多，或血红蛋白因结合其他物质而影响其携氧能力，则会引起血液性缺氧;氧化呼吸链受到毒物作用会引起组织性缺氧。

【动物】体重相近、性别相同的成年小鼠7只，新生幼鼠1只。

【药品与器材】钠石灰( NaOH·CaO)，5%亚硝酸钠，7%枸橼酸钠，0．2%氰化钾，1%亚甲蓝(美蓝)，生理盐水;测氧仪，小鼠缺氧瓶( 125 ml广口瓶)装置，剪刀、镊子，滴管，试管，1 ml注射器及针头5副，5 ml注射器及针头2副，小鼠尸体解剖板，软木塞或橡皮塞少许，一氧化碳。

【实验步骤】

［实验3．2．1］乏氧性缺氧(吸入气中PO2降低)

( 1)取性别相同、体重差别不超过1 g的成年小鼠2只，分别装入置有钠石灰或玻璃珠的广口瓶内，装置见图5- 3- 3。

图5- 3- 3　小鼠缺氧瓶装置

( 2)同时密闭两瓶，记录时间。观察两小鼠在密闭瓶内的活动、呼吸(在小鼠静态时观察其腹部起伏运动的频率和幅度)和皮肤黏膜颜色(观察无毛发部位如嘴唇、脚掌、耳朵和尾巴等)的改变，直至其中一只死亡，记录死亡时间并立即分别测两瓶内的氧浓度。

( 3)继续观察未死亡的小鼠，直至死亡，记录死亡时间，测定该瓶内气体的氧浓度。

( 4)尸检:小鼠死亡后尽快打开胸腔，剪破心脏，立即滴入两滴7%枸橼酸钠溶液，使之和心血混匀，再取两滴抗凝血加入装有5 ml蒸馏水试管内颠倒混匀，观察血液颜色，并与内脏颜色一起与［实验3．2．2，3．2．3，3．2．4］的血液及内脏颜色结果对比。

［实验3．2．2］一氧化碳中毒性缺氧

( 1)取小鼠1只，观察其正常表现。

( 2)调节一氧化碳中毒装置的煤气流量约每分钟60个小气泡，见图5- 3- 4。将小鼠放入广口瓶内密闭瓶口，观察记录小鼠的活动、呼吸深度及口唇、耳、尾等皮肤黏膜颜色的变化，记录密闭瓶口后至小鼠死亡所需的时间。

( 3)特别观察并记录死亡小鼠皮肤黏膜颜色的改变。

( 4)尸检:方法与观察指标同［实验3．2．1］。

图5- 3- 4　一氧化碳中毒装置

［实验3．2．3］亚硝酸钠中毒性缺氧

( 1)取体重相近的小鼠2只，同上观察正常表现后，腹腔注射5%亚硝酸钠0．15 ml/10 g，其中一只注入亚硝酸钠后立即再向腹腔内注入1%亚甲蓝(美蓝)溶液，另一只注射生理盐水，容积与亚硝酸钠相同。

( 2)观察指标与方法同［实验一］，比较两鼠表现及死亡时间有无差异。

( 3)尸检:方法与观察指标同［3．2．1］。

［实验3．2．4］氰化钾中毒性缺氧

( 1)取小鼠1只。同上观察正常表现后，腹腔注射0．2%氰化钾0．15ml/10g。

( 2)观察指标同［实验3．2．1］。

( 3)尸检:方法与观察指标同［实验3．2．1］。

［实验3．2．5］年龄因素对缺氧耐受性的影响

( 1)取1只新生幼鼠，放入青霉素小瓶内，覆盖少量棉花于瓶口内，以免被成年鼠咬伤;再取1只成年鼠，两鼠并置于一广口瓶内，观察并记录两鼠正常活动情况。

( 2)将瓶密闭，记录时间。

( 3)记录两鼠死亡时间，计算两鼠存活时间。

【注意事项】

1．做［实验一、五］时，所有广口瓶必须密闭不漏气，盖盖时必须确保瓶盖塞紧;且各组广口瓶容量应一致，内置物所占据的空间体积应相同，以免影响实验结果。

2．取心血时要充分与抗凝剂混匀，各小鼠所加抗凝剂量、所取血量必须一致，所用玻璃滴管的管口直径、玻璃试管的管径要尽可能保持一致，否则会造成吸血量的误差，影响血液颜色的可比性。试管应事先编号，以免搞错。

3．氰化钾有剧毒，勿沾染皮肤、黏膜，特别是有破损处。

4．记录时间要准确，以同一只钟表上的时间读数为准。

5．要认真仔细观察小鼠的活动情况，呼吸深度和口唇、耳、尾皮肤黏膜颜色的变化。

【思考题】

1．请阐述各配对比较缺氧小鼠的存活时间差异及其发生机制。

2．实验一中两小鼠的瓶内氧浓度有何变化?其发生机制是什么?

3．各种缺氧小鼠的口唇黏膜、耳、尾及血液颜色的改变有何不同?为什么?

4．幼鼠和成年鼠对缺氧耐受的反应有何不同?为什么?

(杨轶群)

实验3．3　家兔急性呼吸衰竭

【目的】

1．学习家兔急性呼吸衰竭模型的复制方法。

2．观察家兔急性呼吸衰竭时呼吸及血气分析的变化并分析其机制。

【原理】通气障碍、气体弥散障碍和肺泡通气血流比例失调是呼吸衰竭的主要发生机制。本实验通过夹闭家兔气管造成窒息，复制通气障碍所致的急性呼吸衰竭;并通过造成家兔开放性气胸及静脉注射肾上腺素造成肺水肿复制肺泡通气/血流比值失调和气体弥散障碍所致的急性呼吸衰竭。

【动物】家兔，体重2～3 kg。

【药品与器材】1．5%戊巴比妥钠溶液(或20%乌拉坦溶液)，0．08%肝素溶液，0．1%肾上腺素，生理盐水，兔手术台，哺乳动物手术器械一套，动脉夹，气管插管(两侧套有橡皮管)，连有三通开关的动脉插管，水检压计(连有三通开关)，听诊器，天平，小软木塞4个，注射器1 ml 4副，2、5、10、20、50 ml注射器各1副，6、9、16号针头，头皮针，输液装置一套，SKY型生物信号处理系统，血气分析仪。

【实验步骤】

1．家兔称重后，从耳缘静脉缓慢注入1．5%戊巴比妥钠溶液30mg/kg或20%乌拉坦溶液1 g/kg，麻醉后仰卧位固定。

2．颈部剪毛，正中切口，切口长5～7 cm，逐层钝性分离颈部组织，暴露出气管并在其下穿一根粗结扎线，在气管上剪一“⊥”形切口，插入气管插管并结扎固定。

3．分离膈肌(详见第三章第五节，二、手术)，将膈肌电极小心插入膈肌，避免出血，将接地线夹于皮肤切口，电极插头连接SKY- A4型生物信号处理系统，描记呼吸(记录并存储膈肌放电生物电放大器参数设置参见实验3．1)。

4．颈总动脉插管，细心分离左侧颈总动脉，并在其下穿两根结扎线，远心端结扎，近心端用动脉夹夹闭，然后用眼科剪在结扎线的近心端将动脉壁剪一约占周径1/2的斜口，插入充满肝素的动脉导管并予固定。导管通过三通开关连接压力换能器，后者连接SKY- A4型生物信号处理系统。打开动脉夹描记血压，血压测定方法参见实验2．1。

5．全身肝素化。耳缘静脉注射0．08%肝素溶液3 ml/kg。

6．观察家兔呼吸衰竭前的呼吸、血压，并存储一段正常时的呼吸、血压曲线。

7．用1 ml注射器吸取少量肝素溶液，将其内壁湿润后推出，将针头刺入小软木塞以隔绝空气。缓慢打开三通开关，弃去最先流出的2、3滴血液后，拔去已肝素化的注射器针头，将注射器插入三通开关接口取血0．5 ml(注意勿进气泡)，然后取下注射器迅速套上插有小软木塞的针头，立即进行血气分析。

8．模型复制

( 1)窒息　用止血钳将气管插管的橡皮管完全夹闭，使家兔处于完全窒息状态30 s，用上述方法取血0．5 ml，做血气分析，并观察呼吸、血压的变化。打开止血钳，等15 min左右，待家兔呼吸恢复正常。

( 2)气胸　于家兔右胸第4～5肋间隙与腋前线交界处插入一16号针头，有突破感表示进入胸膜腔，造成右侧开放性气胸。为使进针部位及深度准确，也可将该部皮肤切开后进针，并且穿刺针头用三通连上水检压计，当针头垂直刺入1～1．5 cm，有突破感，水检压计的液平面降至负值时，可以确定针头已插入胸膜腔，然后旋转三通开关方向，使胸膜腔与大气相通。造成开放性气胸10 min，按同样方法取血进行血气分析。同时观察呼吸、血压的变化，并存储记录。

取血后，用50 ml注射器将胸膜腔内的空气抽尽，拔出针头，等15 min左右，待家兔呼吸恢复正常。

( 3)肺水肿　以10～12 ml/min(每分钟150～180滴)的速度由耳缘静脉输入生理盐水100 ml/kg，输完后将0．1%肾上腺素1 ml/kg缓慢静脉推注。然后仍以生理盐水每分钟10～15滴维持静脉通路，以便必要时重复给药。

静脉给药时，要密切观察:①是否出现呼吸困难、急促，呼吸曲线是否发生变化。②气管内是否有粉红色泡沫样液体溢出。③肺部是否出现湿性啰音。如出现上述肺水肿表现时，立即取血进行血气分析。如肺水肿表现不明显时，可重复使用肾上腺素，方法同上，直至出现肺水肿表现。

取血同时夹闭气管，处死家兔，打开胸腔，在气管分叉处结扎气管以防止肺水肿液流出，在结扎处以上切断气管，分离心脏及血管(分离前需结扎)，将肺取出。称肺重，计算肺系数。肉眼观察肺体积、颜色的改变，并切开肺观察有无泡沫样液体流出。

肺系数计算:肺系数=肺重量( g) /体重( kg)

正常肺系数为4～5。

【注意事项】

1．取血做血气分析时，切忌接触空气，否则影响血气分析结果。

2．取肺时不要损伤肺组织，以免肺水肿液流出，影响肺系数的准确性。

3．气胸后一定要抽尽胸腔内的空气。

【思考题】

1．窒息、气胸及肺水肿分别引起哪一型呼吸衰竭?为什么?(www.xing528.com)

2．在复制肺水肿时为什么先快速、大量输液，然后给肾上腺素?

(宁艳霞)

第四节　血液系统实验

实验4．1　血液凝固

【目的】了解血液凝固过程及其影响因素。

【原理】血液凝固过程可分为3个阶段:凝血酶原酶复合物的形成、凝血酶原激活成凝血酶和纤维蛋白原转变为纤维蛋白。因子Ⅹ的激活可分为内源性和外源性两条途径。若直接从血管中抽血观察血液凝固，此时因血液几乎没有与组织因子接触，其凝血过程主要由内源性途径所激活。若将兔脑浸液(脑组织中含丰富的组织因子)加入血液中，可观察外源性凝血过程。

【动物】家兔。

【药品与器材】清洁小试管9支、50ml小烧杯2个、100ml烧杯1个、0．5ml吸管6支、10 ml注射器、5号针头、滴管、试管架、恒温水浴器、秒表、哺乳动物手术器械、兔手术台、动脉夹、塑料动脉插管、带橡皮刷的玻棒或竹签、棉花、20%氨基甲酸乙酯、富血小板血浆、兔脑浸液、1/40mol CaCl2溶液、生理盐水、肝素8u(置小试管中)、草酸钾1～2 mg(置小试管中)、液状石蜡、碎冰块。

【实验步骤】

1．耳缘静脉缓慢注入20%氨基甲酸乙酯5 ml/kg，待其麻醉后取仰卧位固定于兔手术台上。

2．剪去颈部的毛，沿正中线切开颈部皮肤5～7 cm，分离皮下组织和肌肉，暴露气管，在气管两侧的深部找到颈总动脉。分离出一侧颈总动脉，在其下穿过两条丝线。一线在颈总动脉远心脏端结扎，另一线备用(供固定动脉插管用)。

3．在颈总动脉近心端夹上一动脉夹，然后在靠近远心端结扎处用小眼科剪作一斜切口，向心脏方向插入动脉插管，用丝线固定。需放血时开启动脉夹即可。

【观察项目】

1．观察纤维蛋白原在凝血过程中的作用由颈总动脉插管放血10 ml，分别注入两个烧杯内，一杯静置，另一杯用带橡皮刷的玻璃或竹签不断搅拌，随后洗净玻璃和竹签，观察纤维蛋白呈丝状且有弹性，比较两杯血液的凝固现象。

2．观察血液凝固的影响因素取干净的小试管6支，按表5- 4- 1准备。由颈总动脉插管放血，各管加血1 ml，每30 s倾斜试管一次，直至血液凝固不再流动为止。记录凝血时间。

3．观察内源性凝血及外源性凝血过程取干净的小试管3支，按表5- 4- 2依次加入各成分，摇匀，每15 s倾斜试管一次，分别记录各试管的凝血时间，分析产生差别的原因。

表5- 4- 1　影响血液凝固的因素

表5- 4- 2　内源性和外源性凝血途径的观察

【注意事项】

1．观察项目一和二可同时进行，仅须放血一次。若须进行第二次放血时，最先从插管内流出的血液应弃去。

2．准确记录凝血时间。

【思考题】

1．生理性止血分为哪几个阶段?简述血液凝固的基本过程。

(薛　红)

实验4．2　红细胞渗透脆性

【目的】通过观察红细胞对不同浓度的低渗盐溶液的抵抗力，加深理解细胞外液渗透张力对维持红细胞正常形状与功能的重要性，学习测定红细胞渗透脆性的方法。

【原理】红细胞对低渗盐溶液具有一定的抵抗力，这种抵抗力的大小，可以作为红细胞渗透脆性的指标。抵抗力小，表示渗透脆性大;反之则表示渗透脆性小。同一个体的红细胞，其渗透脆性并不完全相同。将血液滴入不同浓度的低渗NaCl溶液中，开始出现溶血现象的NaCl溶液浓度，为该血液红细胞的最小抵抗力，即最大脆性值(正常为0．40%～0．44%NaCl溶液) ;出现完全溶血时的低渗NaCl溶液的浓度，则为该血液红细胞的最大抵抗力，即最小脆性值(正常为0．32%～0. 36%NaCl溶液)。生理学上将能使悬浮于其中的红细胞保持正常体积和形状的溶液称为等张溶液。等张溶液一定是等渗溶液，但等渗溶液不一定是等张溶液，如1．9%的尿素溶液。

【实验对象】人或动物。

【药品与器材】1%NaCl溶液，0．85%NaCl溶液，蒸馏水，1．9%尿素溶液，75%乙醇，碘酒;试管架，小试管( 10mm×75mm) 15支，2ml吸管4支，显微镜，载玻片，盖玻片，消毒的5 ml注射器及8号针头，棉签。

【实验步骤】

1．制备各种浓度的低渗盐水溶液取干净小试管12支，依次编号排列在试管架上，按表5- 4- 3分别用2支2 ml吸管向各小试管内加入1% NaCl溶液和蒸馏水，混匀，配制成从0．24%～0．68%12种不同浓度的NaCl低渗溶液。

表5- 4- 3　各种浓度的低渗盐水溶液配制表

另取3支小试管，编号13～15，分别用2 ml吸管加入0．85% NaCl、1．9%尿素溶液和蒸馏水2．5 ml。

2．采血　如用人血，先用碘酒、乙醇消毒皮肤，再用灭菌干燥的注射器从肘正中静脉取血1 ml;如用狗血，可不必消毒注射器和针头，由小腿皮下静脉采血;如用兔血，可由心室或耳缘静脉取血。

3．取血后立即依次向15支试管内各加血一滴，血滴大小要尽量保持一致，轻轻颠倒混匀，切勿用力振摇。进行下列观察。

【观察项目】

1．观察第13、14、15管的变化，比较其溶血情况，并分析原因。其余12管在室温下静置1 h。根据混合液的颜色和浑浊度的不同区分为下列3种现象。

( 1)小试管内液体完全变成透明红色，管底无细胞，说明红细胞全部破裂，称为全部溶血。

( 2)小试管内液体下层为浑浊红色，表示有未破裂的红细胞，而上层出现透明红色，表示部分红细胞破裂，称为不完全溶血。

( 3)小试管内液体下层为浑浊红色，上层为无色透明的液体，说明红细胞完全没有破裂。

2．记录所测定的红细胞脆性范围(即开始出现溶血时的NaCl溶液浓度与完全溶血时的NaCl溶液浓度)。

3．取第6管和第13管混合液各一滴，放在载玻片上，加上盖玻片，在显微镜观察红细胞形态，比较其差别。

【注意事项】

1．配制不同浓度的NaCl溶液时应力求准确无误。

2．抽取静脉血液速度应缓慢;向试管滴加血液时要靠近液面，使血滴轻轻滴入溶液中，避免人为造成红细胞破裂而出现溶血假象。

3．为使各管加血量相同，加血时持针角度应一致。

4．观察结果应在明亮处，必要时吸取试管底部悬液一滴，在显微镜下观察。

【思考题】

正常人体血液中红细胞为什么能保持正常的形态和大小?

(刘　俊)

实验4．3　家兔实验性弥散性血管内凝血( DIC)

【目的】应用静脉注射兔脑浸液方法，复制家兔实验性DIC。通过实验和几项血液学指标的测定及结果分析，了解实验室诊断DIC的常用方法，联系理论知识加深理解DIC的病因及发病机制。

【原理】脑、肺、胎盘、前列腺等组织器官富含组织因子，当这些组织被损伤破坏时就会有大量组织因子释放入血，从而引发DIC。临床实验室检查有血小板计数、纤维蛋白原含量、凝血酶原时间和3P试验(或D-二聚体，或优球蛋白溶解时间)异常，结合病因、病史可初步确诊DIC的发生。

【动物】正常家兔，体重2～3 kg，雌(无孕)雄不限。

【药品与器材】2%兔脑浸出液(临用前配)，1%普鲁卡因溶液，3．8%枸橼酸钠溶液(存4℃)。25 mmol/L氯化钙溶液(存4℃)，KPTT试剂，PT试剂，饱和盐水(氯化钠溶液)，生理盐水( 10 ml安瓿装和自配两种)，1%鱼精蛋白溶液(存4℃)，血小板稀释液;兔手术台，手术器械，电热恒温水浴箱，离心机，752分光光度计，秒表，号码计数器，显微镜，刻度离心管( 10 ml×2支)，试管( 13 mm×75 mm×4支，15 mm×100 mm×6支)，刻度吸管( 5 ml×2支)，移液器( 10、20、50、500 μl)，毛细滴管，洗耳球，乳胶滴头，平皿(φ90 mm，150 mm)，棉花，纱布。

【实验步骤】

1．家兔仰卧位固定，手术部位剪毛，行局部麻醉(详见第三章第五节)。

2．颈动脉插管术(详见第三章第五节)。

3．第一次采集血标本

( 1)从颈动脉插管放血4．5 ml至盛有3．8%枸橼酸钠溶液0．5 ml的10 ml刻度离心管内，立即反复颠倒混匀(切忌振荡混匀)，待离心。

( 2)紧接上步，用10 μl移液器直接从动脉导管口吸取10 μl血液迅速吹入置有2 ml血小板稀释液的试管( 13 mm×75 mm)中，充分混匀待计数。

( 3)放血后，拔去动脉插管，换插新的动脉插管(或保留插管，向插管内推入生理盐水，夹闭动脉夹，确保导管内无血液)。如天气炎热，为避免水分过多蒸发，可从耳缘静脉补充生理盐水5～10 ml。

4．复制DIC模型　按60mg/kg体重，用10ml注射器抽取2%兔脑浸出液，经耳缘静脉缓慢推注，注入速度为每分钟2 ml左右。同时密切观察家兔反应，如出现呼吸急促、躁动不安，当即停止注射，迅速进行第二次采血。

5．第二次采血　注射完兔脑浸液后立即或间隔30 s左右采血，内容及方法同第一次的( 1)、( 2)项。

6．进行各项指标测定　将前后两次所得的抗凝血，经3 000 r/min离心5 min，将上层血浆分别吸至2支清洁试管( 15 mm×100 mm)中，切忌吸入细胞成分，并做好标记备用。

【测定指标及方法】

1．血浆白陶土部分凝血活酶时间( kaolin partial thromboplastin time，KPTT;玻片法)测定。

( 1)将试验用清洁平皿和25 mmol/L氯化钙溶液(盛在15 mm×100 mm试管内)置37℃水浴中预热。

( 2)用移液器吸取20 μl血浆滴加在上述平皿上，再吸取KPTT试剂(吸取前需摇匀) 20 μl加入血浆液滴中，用清洁注射针头混匀之。

( 3) 3min后，在上述混悬液滴中滴加20 μl预热的25 mmol/L氯化钙溶液，立即按动秒表，用针头混均并不断缓慢挑拨之，一旦挑出丝状物，随即终止秒表，记录时间，此即KPTT。

原理:在37℃下，以活化剂(白陶土)激活因子Ⅻ和Ⅺ，以部分凝血活酶脑磷脂悬液代替血小板提供凝血的催化表面，在Ca2+参与下，观察血浆凝固所需时间。

2．血浆凝血酶原时间( prothrombin time，PT;玻片法)测定

( 1)将清洁平皿置37℃水面预热。

( 2)用移液器吸取20μl血浆滴加在预热平皿上，预热1～2min，再吸取PT试剂40 μl(内含CaCl2)滴加在血浆中，立即揿动秒表。用清洁针头不断混匀并挑拨，一旦挑出丝状物，即刻终止秒表，记录所需时间。

原理:在受检血浆中加入过量的组织凝血活酶(兔脑、人脑、胎盘、肺等组织浸出液)和Ca2+，使凝血酶原转化为凝血酶，后者使纤维蛋白原转变为纤维蛋白即发生凝固;其凝固时间的长短是反映血浆中凝血酶原因子Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ及纤维蛋白原的水平。

3．纤维蛋白原含量测定(饱和盐水法)

( 1)取15 mm×100 mm试管4支，按图5- 4- 1分别编号为1、2、3、4。

图5- 4- 1　纤维蛋白原含量测定示意图

( 2) 1、2号管各加入正常血浆0．5 ml，3、4号管各加入DIC血浆0．5 ml。

( 3) 1、3号管各加入生理盐水4．5 ml，立即反复颠倒混匀，置37℃水浴孵育3 min，作为对照管。

( 4) 2、4号管各加入饱和盐水4．5 ml，立即反复颠倒混匀，置37℃水浴孵育3 min，作为测定管。

( 5)用752型分光光度计，选取520 nm波长滤光板，以1号对照管调零，读取2号测定管光密度( OD)值。同样以3号对照管调零，读取4号测定管光密度( OD)值(测定前再次颠倒混匀各管)。

( 6)计算纤维蛋白原含量

原理:通过盐析，使血浆中蛋白析出，由于血浆中纤维蛋白原含量最多，且在DIC发生前后其他蛋白因未发生量的改变，而纤维蛋白原变化明显，故析出物可反映纤维蛋白原量的变化。由于方法粗略，该指标为半定量指标。

4．血浆鱼精蛋白副凝固试验( plasma protamine paracoagulation test，3P)

( 1)吸0．5 ml血浆加入洁净13 mm×75 mm试管中，加入1%鱼精蛋白溶液50 μl(注意一定要先加血浆)，轻轻摇匀，置37℃水浴。

( 2) 15 min后取出，在灯光下对黑色背景一边晃动试管一边观察，溶液清澈者为阴性，出现絮状沉淀或胶冻状物为阳性。

原理:该指标测定血浆中纤维蛋白单体( FM)和FDP(主要为X碎片)的存在。DIC时FM 和FDP增多并形成可溶性复合物，在该血浆中加入鱼精蛋白，可使复合物解离，游离出的FM便会相互聚合形成不溶性的肉眼可见的颗粒状、絮状或胶冻状沉淀，这种无需酶而引起纤维蛋白凝固的作用称为副凝现象，此即为3P阳性。

5．血小板计数( blood platelet count，BPC)

( 1)充分混匀血液-血小板稀释液，用毛细滴管吸取少许加到血球计数板的计数池内，放在平皿内加盖静置15 min(平皿内放一湿棉球，以防水分蒸发)。

( 2)在高倍镜下计数中央大方格(即25个中方格，400个小方格，如图5- 4- 2)内血小板数，压线者取上左，弃下右。血小板体积极小，为红细胞的1/5～1/3，呈圆形或不规则形，染成淡黄色，有轻度折光性。

图5- 4- 2　血球计数板模拟图( *粗线亦表示双线)

( 3)所得数乘以2 000即为血小板数/mm3。

【注意事项】

1．采血时动脉夹在原位打开，不得离开血管，以免放血后不能及时夹闭动脉造成失血。

2．采集抗凝血需准确掌握血液与抗凝剂的比例。

3．注射兔脑浸液前，要做好第二次采血的一切准备工作，如换好新的动脉插管(因原插管内可能已有血栓阻塞)或向插管内注入生理盐水，准备好抗凝管、玻片、秒表。这是因为注射兔脑浸液过程中家兔极易猝死，如到临时再作准备，则往往是待到准备妥当，家兔已死亡。

4．注射兔脑浸液时要掌握好推注速度，密切注意家兔反应。

5．离心分离血浆前，必须先平衡离心管。

6．测KPTT、PT的平皿必须清洁，无油脂;试剂使用前需充分摇匀，切勿混入水和杂物。

7．测纤维蛋白原含量时，血浆一旦与饱和盐水接触，须立即充分混匀，以防产生局部沉淀，同样，比色前需再次混匀。

8．测3P时，试管一定要清洁(尤其是管底)，应先加血浆再加鱼精蛋白，以免鱼精蛋白接触管底不洁物造成假阳性。

【思考题】

1．静脉注射兔脑浸液后为何能复制出家兔DIC模型?试述其发生机制。

2．所测得的各项指标的前后变化说明什么?分析其产生的原因和机制。

(杨轶群)

第五节　消化系统实验

实验5．1　胆汁分泌的调节

【目的】学习胆汁分泌的记录方法，观察影响家兔胆汁分泌的因素。

【原理】正常情况下，胆汁由肝脏不断分泌产生。在非消化期间，肝胆汁大部分流入胆囊内储存、浓缩;在消化期，在神经和体液因素影响下，胆囊收缩，Oddi括约肌舒张，胆汁排入十二指肠，参与小肠内的消化过程。食物是引起胆汁分泌和排出的自然刺激物。迷走神经兴奋引起胆汁分泌少量增加，胆囊收缩轻度增强。缩胆囊素、胃泌素、促胰液素和生长抑素通过作用于肝细胞和(或)胆道系统影响胆汁的分泌。胆盐的肠肝循环有利于胆汁的分泌。胆汁收集方法主要包括胆总管插入法、胆囊瘘管法、十二指肠瘘管法等。本实验采用胆总管插入法收集肝胆汁和胆囊胆汁。

【动物】家兔。

【药品与器材】哺乳动物手术器械，保护电极，受滴器，SKY型生物信号处理系统，细塑料管，培养皿，10 ml注射器2支，水浴锅，1．5%戊巴比妥钠溶液(或20%乌拉坦溶液)，1∶10 000乙酰胆碱溶液，0．5%盐酸溶液，阿托品针剂，生理盐水，粗制促胰液素。

【实验步骤】

1．称重、麻醉、固定及气管插管(方法见实验2．1)。

2．暴露迷走神经胃前神经丛剪去腹部兔毛，沿腹白线从剑突向下做4～5 cm长的切口，将肝脏轻轻向上推，暴露出贲门与胃小弯交界处，剪开腹膜，即可见迷走神经胃前神经丛，穿线备用。

3．分别在十二指肠上端和空肠上端穿一粗棉线，备用。

4．胆总管插管通过胆囊及胆囊管的位置，在十二指肠降支起始部位找到胆总管，轻轻将其分离后，紧靠十二指肠将胆总管穿线结扎。然后在胆总管上剪一斜口，插入细塑料管扎紧固定(图5- 5- 1)。塑料管另一端连受滴器，胆汁滴信号输入生物信号处理系统。

图5- 5- 1　胆总管插管法收集胆汁示意图

5．按图5- 6- 1(见实验6．1尿量检测装置示意图)连接实验装置，胆汁信号由通道2输入。调节好放大器的位移和增益，D/A- 1或D/A- 2的输出接刺激电极，将幅度电位器顺时针方向调到最大( D/A- 1: 5V，D/A- 2: 10V)。

6．运行MFLab200．EXE。

7．观察项目

( 1)记录静息状态下胆汁信号，连续记录2～5 min。

( 2)用中等强度电脉冲刺激迷走神经胃前神经丛2min(刺激强度为2 V，频率为10 Hz，或根据试验情况而定)。

( 3)将分泌出的胆汁用生理盐水稀释10倍，耳缘静脉注射5 ml。

( 4)耳缘静脉注射1∶10 000乙酰胆碱溶液0．4～0．5 ml/kg。

( 5)将事先穿放在十二指肠上端和空肠上端的两根粗棉线扎紧。向十二指肠腔内注入37℃温热的0．5% HCl 25～40 ml。

( 6)耳缘静脉注射粗制促胰液素5～10 ml。

( 7)耳缘静脉注射阿托品0．5 mg，3 min后重复观察项目的( 2)～( 6)项。

【注意事项】

1．肝脏非常容易出血，操作时须轻柔，避免锐利器械碰、划肝脏。

2．胆总管附近血管丰富，分离时须仔细。

3．胆总管壁薄、柔软而易折叠，插管时不要损伤。记录过程中，尤其在刺激迷走神经时，应避免其扭曲折叠。

4．胆总管插管不必很深，以牢固固定为前提。

5．插管前细塑料管内预先充满生理盐水，但收集分泌出的胆汁时，应弃去先前充入管内的生理盐水。

6．腹部手术野在观察项目中应该用浸湿温热生理盐水的纱布遮盖。

7．胆总管插管应尽可能一次插成，防止损伤黏膜面造成出血，继而堵塞管道。

【思考题】

1．试述迷走神经在胆汁分泌调节中的作用。

2．耳缘静脉注入胆汁稀释液为何能促进胆汁分泌?

3．十二指肠内化学性刺激对胆汁分泌有何影响?

4．促胰液素的作用机制是什么?

5．如果需要分别观察各种因素对肝胆汁和胆囊胆汁分泌的影响，应如何设计实验?

【注】促胰液素的粗制方法:在急性动物实验后刚死亡的动物身上，从十二指肠起始部开始向下取约70 cm小肠。将小肠冲洗干净，纵向剪开，用刀柄刮取全部黏膜放入研钵，加入10～15 ml的0．5%盐酸研磨。将得到的稀浆倒入烧杯中，加入0．5% HCl 100～150 ml，煮沸10 min。用10%～20%NaOH趁热中和(用pH试纸或pH计检查)至中性，滤纸趁热过滤，得到粗制促胰液素，低温保存。

(王铭洁)

实验5．2　消化道平滑肌生理特性及药物对离体肠段的作用

【目的】观察离体豚鼠回肠平滑肌的一般生理特性，分析不同药物对哺乳动物消化道平滑肌的作用及其机制。

【动物】豚鼠，350g左右。

【药品与器材】洛氏液，“A”、“B”液，阿托品，苯海拉明，氯化钡;超级恒温槽，麦氏浴槽，张力换能器，微调夹，铁支架，双凹夹，延伸棒，鳄鱼夹，“L”形钩，SKY型生物信号处理系统，氧气及供气系统，手术线，手术缝针，持针钳，恒温水浴锅，量筒，烧杯，培养皿，手术器械等。

【实验步骤】

1．标本制作　用木槌猛击豚鼠头的枕部使其昏迷后，迅即剖开腹腔，找到回盲部，在离其2～3 cm处剪取长20～30 cm的回肠一段，置于通氧的37℃左右的洛氏液内轻轻漂洗;待肠腔内容物基本洗净后，将其分成数段，每段长约2 cm，置上述洛氏液中备用。

图5- 5- 2　离体肠段实验装置示意图

2．实验装置　于实验前检查并调试超级恒温装置及仪器连接(图5- 5- 2)，张力换能器连接于生物放大器，低频滤波选DC。麦氏浴槽内盛入洛氏液20ml，并恒温于37℃，标记液面高度。取上述备用回肠一段，两端均用缝针穿线，其一端连线固定于“L”形钩上，然后迅速移置于麦氏浴槽中，将另一端连线系于张力换能器上并保持连线处于垂直位置和适宜的松紧度(切忌用力牵拉张力换能器)，并使肠段保持约1 g后负荷的张力。将氧气管经针头从底部向麦氏浴槽缓慢通气(每秒钟1～2个小气泡，通氧速度过快会影响肠的活动)，以提高洛氏液的含氧量。

3．运行MFLab200．EXE选择“消化道平滑肌生理特性及药物对离体肠的作用”，单击“确定”。

在菜单“功能选择”项下选择“采集信号”或直接单击工具条上的“采集信号”图标。启动采样后，屏幕中间为信号显示窗口。屏幕右边为实验控制面板。

通过实验控制面板设置实验参数和控制实验进程。X轴扫描时间根据需要设定。

实验前作定标，方法如下:

先将张力换能器悬空，单击“定标”按钮，稍后程序显示一个对话框，在对话框内选择“低值定标”，按“确定”。再悬挂1．0 g砝码，单击“定标”按钮，在对话框内选择“高值定标”，按“确定”，定标完毕。如不作定标，张力数值为相对值。

在张力换能器上挂上平滑肌，松紧适中，调整曲线基线。

“储存”、“标记”、“浏览和测量”、“增大X轴时间”、“减小X轴时间”和“打印”等操作同实验2．1。

4．观察温度对肠平滑肌运动的影响

( 1)将浴槽内洛氏液温度维持在37℃，观察并记录正常肠段运动，作对照。

( 2)用25℃的洛氏液更换浴槽内37℃洛氏液，观察并记录肠段运动的变化。

5．观察药物作用对肠平滑肌运动的影响每次给药前先记录正常肠张力变化曲线，记录药物作用明显时的肠张力变化，然后用洛氏液洗涤2次(下称换液)，待前面一个药物作用完全消失后，再给予下一个药物。每一步操作均在程序中做好标记。

给药顺序如下:

( 1)加入1∶10 000或1∶1 000“A”液0．2 ml于麦氏浴槽中，待作用充分发挥后，取37℃的新鲜洛氏生理溶液洗2次。待肠张力恢复正常后加入1∶10 000“B”液0．3 ml，观察并记录反应。换液。

( 2)加入1∶10 000或1∶1 000“A”液0．2 ml于麦氏浴槽中，待作用达最高峰时，立即加入1∶1000阿托品溶液0．2ml，观察并记录反应;待曲线恢复正常后再加入等量“A”液，观察并记录反应;待曲线恢复正常后再加入1∶10 000“B”液0．3ml，观察并记录反应。换液。

( 3)加入1∶10 000“B”液0．3 ml于麦氏浴槽中，待作用明显后，加入1∶10 000苯海拉明0．3 ml; 3～5 min后再加等量“B”液，观察并记录反应;待曲线恢复正常后再加入1∶10 000或1∶1 000“A”液0．2 ml，观察并记录反应。换液。

( 4)加入1∶100氯化钡溶液0．2 ml，观察并记录反应，待作用达最高峰时( 15 min后)，加入1∶1 000阿托品溶液0．2 ml，观察并记录反应;待曲线恢复正常后再加入1∶10 000苯海拉明0．3 ml，观察并记录反应。

【注意事项】

1．制备好的离体肠段标本，必须注意保温、通氧，洛氏生理溶液的成分及pH值等各种条件是否合乎规定，在转移肠段的过程中要动作迅速，不能较长时间脱离洛氏液，洛氏液中要始终通氧。

2．肠段标本与张力换能器之间的连线要保持垂直，松紧适当(使波形的高度适当)，避免用力牵引肠段，并且使之不与麦氏浴槽内壁及槽内的“L”形钩杆相贴附。

3．观察肠段的舒缩运动与计算机屏幕上的记录曲线是否一致，即收缩时，曲线上升，舒张时，曲线下降，如记录曲线收缩时下降，舒张时上升，可将张力换能器旋转180°(旋转要在连线放松的状态下进行)。

4．检查肠段是否发生扭动，如发生肠段扭动则应重新固定肠段。

5．张力换能器切忌过度牵拉，以免损坏。

【思考题】

1．你推测“A”液和“B”液各属于哪一类药物?

2．请分析“A”液、“B”液及氯化钡对肠平滑肌的作用结果说明什么?其作用机制如何?

3．根据所绘曲线，讨论抗组胺药对平滑肌的作用。

4．温度降低对消化道平滑肌的收缩运动有何影响?

(刘元元　吴淦桐)

第六节　泌尿系统实验

实验6．1　神经、体液和药物等因素对尿生成的影响

【目的】掌握输尿管插管术，学习尿量的测量和记录方法，观察神经、体液及药物等各种因素对尿生成的影响。

【原理】尿的生成过程包括肾小球滤过、肾小管和集合管的重吸收和分泌过程。肾小球滤过受滤过膜通透性、血浆胶体渗透压、肾小球血浆流量和肾小球毛细血管压等因素的影响，后两者又受肾交感神经及肾上腺素、去甲肾上腺素等体液因子的影响，肾小管重吸收受小管液中溶质浓度等因素的影响。此外，影响尿液浓缩和稀释机制的因素，影响抗利尿激素释放的因素，影响肾素-血管紧张素-醛固酮系统的因素及循环血容量、血压等都能对尿生成发生影响。

【动物】家兔，体重2～3 kg。

【药品与器材】哺乳动物手术器械，保护电极，受滴器，压力换能器，SKY型生物信号处理系统，细塑料管，试管，试管夹，酒精灯，培养皿，滴管，水浴锅，2 000 ml烧杯。1．5%戊巴比妥钠溶液(或20%乌拉坦溶液)，0．1%肝素溶液，20%葡萄糖溶液，1∶100 000去甲肾上腺素溶液，呋塞米(速尿)，班氏试剂，生理盐水。

【实验步骤】

1．一般手术　称重，麻醉( 1．5%戊巴比妥钠溶液30 mg/kg，或20%乌拉坦溶液750～1 000 mg/kg，耳缘静脉注射)，仰卧固定，气管插管。分离右侧颈迷走神经，穿线备用。分离一侧股动脉或颈总动脉，插管记录血压。有条件时可做一颈外静脉插管，外端连一三通开关，以备静脉注射药物用。

2．输尿管插管　在耻骨联合上缘沿正中线向前作5 cm长的纵行皮肤切口，沿腹白线切开腹腔，将膀胱慢慢移出体外，暴露膀胱三角，仔细辨认输尿管，将一侧输尿管与周围组织轻轻分离。穿双线备用，先用一根线结扎输尿管近膀胱端，在结扎处近肾端输尿管剪一斜切口，切口约为管径一半，把充满0．1%肝素溶液的细塑料管向肾脏方向插入输尿管内，并穿线结扎固定，随后可见尿液从细塑料管内慢慢逐滴流出。术毕用浸润温热( 38℃左右)生理盐水的纱布将腹部切口盖住，以保持腹腔内温度。将细塑料管连至受滴器。

3．按图5- 6- 1连接实验装置，血压信号由通道1输入，尿滴信号由通道2输入。调节好压力放大器的位移和增益，D/A- 1或D/A- 2的输出连接刺激电极，将幅度电位器顺时针方向调到最大( 5 V)。

图5- 6- 1　尿量检测装置示意图

4．运行MFLab200．EXE。选择“泌尿生理、肾衰及利尿作用”，单击“确定”。

在菜单“功能选择”项下选择“采集信号”或直接单击工具条上的“采集信号”图标。启动采样后，屏幕中间为信号显示窗口。屏幕右边为实验控制面板。

通过实验控制面板设置实验参数、控制实验进程。X轴扫描时间根据需要设定，“刺激频率”取20 Hz，“刺激时间”根据需要设定，“脉冲宽度”取0．1 ms，“脉冲1强度”取2 V。

接通血压，血压测定方法参见实验2．1。调节周期检测阈值线，屏幕下方显示收缩压、舒张压、平均压、心率和尿滴直方图。尿滴直方图的间隔时间可在“文件/改变实验设置”下改动。

需刺激神经时，单击“刺激”按钮，在D/A口上输出刺激脉冲。

“储存”、“标记”、“浏览和测量”、“增大X轴时间”、“减小X轴时间”和“打印”等操作同实验2．1。

【观察项目】

1．记录静息状态下血压和尿滴信号。

2．增加循环血量，降低血浆胶体渗透压经耳缘静脉或颈外静脉插管缓慢注射37℃注射用生理盐水20 ml，观察血压和尿量变化。

3．间歇刺激颈迷走神经近心端　双线间隔1～2mm结扎右侧颈迷走神经，在两结扎部位之间剪断右侧颈迷走神经，以中等强度重复脉冲，采取短暂间歇多次的刺激方法，刺激右侧颈迷走神经近心端，使血压下降，并维持2min，观察尿量变化。

4．注射高渗葡萄糖　先用一试管接取尿液2滴作尿糖定性试验，然后由耳缘静脉或颈外静脉插管注射20%葡萄糖溶液5 ml，观察血压和尿量变化。在尿量明显增多时，取尿液2滴再次作尿糖定性试验。待尿量恢复至注射葡萄糖前水平时，再取尿液2滴第3次作尿糖定性试验。

5．注射呋塞米　经耳缘静脉或颈外静脉插管注射呋塞米2 ml( 1 mg/ml)，观察血压和尿量变化。

【补充项目】

1．注射去甲肾上腺素　经耳缘静脉或颈外静脉插管注射1∶100 000去甲肾上腺素溶液5 ml，观察血压和尿量变化。

2．放血　分离另一侧股动脉，插管放血，使血压迅速下降至80 mmHg( 10．7 kPa)以下，观察血压和尿量变化。

3．补充生理盐水　放血后，再迅速从耳缘静脉或颈外静脉插管注射温热(约37℃)生理盐水，观察血压和尿量变化。

【注意事项】

1．每项观察前后均须有对照血压和尿量的记录。

2．手术操作应轻柔，不能过度牵拉输尿管，防止输尿管挛缩导致其不能导出尿液，必要时可局部敷用2%普鲁卡因。

3．输尿管插管时，注意不要插入其黏膜层，并避免反复插管，防止损伤黏膜面出血，因血液凝固而堵塞管道。

4．腹部切口不宜过大，并注意保温。

5．输尿管插管不能扭曲，以免引流不畅。

6．若采取经颈外静脉插管注射给药的方法，则应在药物注射完毕后，再推入少许生理盐水，以便将存留在插管内的药物全部注入动物体内。

【附】尿糖定性试验试管内加班氏试剂1 ml，再加尿液2滴，在酒精灯加热煮沸。加热时应注意振荡试管，并防止液体溢出管外，然后仔细观察溶液和沉淀的颜色。若溶液由蓝色透明转为混浊的绿色、黄色或砖红色，则表示不同程度的尿糖试验阳性(绿色+ ;绿黄色+ + ;黄色+ + + :砖红色+ + + + )，若溶液蓝色不变则为阴性(－)。

【思考题】

1．静脉注射大量生理盐水引起尿液增多的机制如何?

2．静脉注入20%葡萄糖溶液5 ml，尿量有何变化?为什么?

(张　威)

实验6．2　急性肾功能衰竭

【目的】

1．用氯化汞复制急性肾功能衰竭的动物模型。

2．观察急性肾功能衰竭时内生肌酐清除率、尿蛋白、滤过钠排泄分数、血尿素氮、血钾和酚红排泄率等变化。

3．加深理解急性肾功能衰竭的病因、发病机制和功能代谢变化。

【原理】肾脏缺血和某些毒物(如重金属、肌红蛋白、毒素等)对肾小管会造成损坏，引发急性肾功能衰竭。通过测定血肌酐、血尿素氮等指标可反映肾功能损坏的情况。

【动物】家兔，2～2．5 kg。

【药品与器材】1%HgCl2溶液，0．9%NaCl溶液，l%普鲁卡因溶液，0．2%肝素溶液，5%葡萄糖注射液，20%磺基水杨酸溶液，肌酐和尿素氮测定试剂盒; FP- 640型火焰光度计，752分光光度计或AT- 658半自动生化分析仪，离心机，10 ml离心管、试管; 0．1、1、5 ml可调移液器，手术器械。

【观察指标】血肌酐、血尿素氮、尿肌酐、尿量、尿蛋白、内生肌酐清除率、血钠、尿钠、滤过钠排泄分数、酚红排泄率和血钾。

【实验步骤】

1．复制模型　实验前48 h取2只家兔，称重后1只皮下注射1% HgCl21．2 ml/kg;另1只则在相同部位注射等量的生理盐水作为正常对照。

2．输尿管插管　造模后48h将上述两兔分别称重，固定于兔台上，腹部剪毛，局麻。在耻骨联合上缘，向上作长约4cm的腹部正中切口，沿腹白线分离皮下组织和肌层，剪开腹膜，暴露膀胱，分离两侧输尿管并作输尿管插管，将导管连接至受滴器(图5- 6- 1)。

3．耳缘静脉注射5%葡萄糖溶液15 ml/kg( 5 min内注完)，以保证有足够的尿量，记录排尿量。尿液用无氨污染蒸馏水作1∶100稀释，以备测定尿中肌酐含量。

4．采血　颈部剪毛，1%普鲁卡因局麻，作颈动脉插管。由颈动脉插管取血2 ml置于盛有0．2%肝素0．1ml的离心管内，充分混匀，离心( 3 000r/min×10min)分离血浆;或取血2 ml直接置于清洁干燥的离心管内，静置，待凝固后离心( 3 500 r/min×10 min)分离血清。以备测定血中肌酐和尿素氮、钾、钠浓度。

5．血、尿肌酐测定方法(表5- 6- 1)和内生肌酐清除率的计算。

表5- 6- 1　血浆和尿液肌酐含量测定操作步骤(长征试剂盒)

混匀，置37℃水浴60 s，在510 nm波长，以空白管调零，读取吸光值( A1)。再于反应120 s时，读取吸光度( A2)。
注: *工作试剂为苦味酸和缓冲液等量混合而成;＊＊质控管可不做; #样本为血清、血浆或尿液。

计算方法:

式中:ΔA = A2－A1

单位换算:肌酐mmol/L×11．3 = mg/dl

或用半自动生化分析仪测定:按表5- 6- 2在AT658-半自动生化分析仪上进行编程设定参数，然后将仪器吸液管分别插入上述各管溶液中吸液并自动测定(参阅第四章第二节，三、“半自动生化分析仪”)。

表5- 6- 2　肌酐测试项目参数(选择二点法)

根据屏幕显示操作，没有参数的项目跳过或设“无”，仪器会自动给出结果并打印。

内生肌酐清除率计算:

6．血尿素氮测定方法按表5- 6- 3操作。

表5- 6- 3　尿素氮测定(长征试剂盒)

混匀，37℃孵育30 s后，在340 nm处以蒸馏水调零，读取吸光度( A30s)，再于60 s时读取吸光度( A90s)，确定两点反应时间。

计算方法:

式中:ΔA = A30s－A90s

单位换算:尿素mmol/L×6．02 =尿素mg/dl;尿素mmol/L×2．802 =尿素氮mg/dl

【注】*质控管可不做。

亦可用半自动生化分析仪测定:操作与肌酐测定相似，按表5- 6- 4编程设定参数。

表5- 6- 4　尿素氮测定编程参数

根据屏幕显示操作，没有参数的项目跳过或设“无”，仪器会自动给出结果并打印。

7．血钾、钠和尿钠测定取血清或血浆50 μl，用蒸馏水稀释100倍后，充分混匀，用FP- 640型火焰光度计测定钾、钠浓度;尿液作适当稀释后用同样方法测定其钠浓度。

8．滤过钠排泄分数( FENa)和肾衰指数的计算:

9．尿蛋白定性试验取膀胱尿5 ml，加入20%磺基水杨酸溶液1 ml，摇匀后即可在灯光下对着黑色背景对照表5- 6- 5观察尿液浑浊情况。

表5- 6- 5　尿蛋白定性标准

观察结果时需注意:

( 1)本法敏感，能检出极微量蛋白，无临床意义。

( 2)判断结果应严格控制在1 min内，否则随时间延长可导致反应强度升级。

( 3)混浊尿应离心后取上清液做试验，强碱性尿应使用稀乙酸酸化尿液至pH 5．0后再做试验。

10．形态学观察　处死动物，取出两侧肾脏，沿肾之凸面中部作一水平切面，深达肾盂，注意肾包膜情况，切面的色泽、皮质与髓质分界是否清楚等，并与对照组兔肾作比较。

【注意事项】

1．肌酐试剂具有强碱性，若有接触，立即用大量流水冲洗;苦味酸可引起变态反应并具有爆炸性，配制时应先在容器内加少许蒸馏水，以防意外。

2．根据不同仪器的要求，试剂与样本用量可按比例改变。

3．测定结果的准确性依赖于仪器的校正和测定温度、时间的控制。

4．正常家兔血清尿素氮含量14～20 mg/dl，急性氯化汞中毒性肾病家兔血清尿素氮为正常值的1～2倍。

5．若样品中测定值过高(尿素浓度＞43 mmol/L或尿素氮浓度＞120 mg/dl，肌酐浓度＞2 mmol/L)时，应以无氨生理盐水稀释，计算时乘以稀释倍数。

6．使用不同的试剂盒按照其说明书操作。

【思考题】

1．请叙述HgCl2引起急性肾功能衰竭的具体机制。

2．所测定的各项指标反映了什么?为什么?

(杨轶群)

第七节　人体功能实验

实验7．1　感觉器官生理实验——视野的测定和声波的传导途径

［实验7．1．1］视野的测定

【目的】学习用视野计测定视野的方法，测定正常人的各色视野，了解测定视野的意义。

【原理】单眼固定地注视前方一点时，该眼所能看到的范围，称为视野。视野的最大界限应以它和视轴形成的夹角大小来表示。在同一光照条件下，用不同颜色的目标物测得的视野大小不一。视野的大小可能与各种感光细胞在视网膜中的分布范围有关。

【实验对象】人。

【主要器材】视野计、各色(白、红、绿、蓝)视标、视野图纸、铅笔。

【实验步骤】

1．了解视野计的结构(图5- 7- 1)，熟悉它的使用方法。

2．将视野计放在光线充足的桌台上，受试者背对光线、面对视野计而坐。下颌靠在视野计的托颌架上，右侧眼眶下缘靠在眼眶托上，调节托颌架高度，使眼睛恰与弧架的中心点位于同一水平面上。

图5- 7- 1　视野计结构

3．将弧架转到水平位置，遮住左眼，令右眼注视弧架的中心点。

4．实验者持视标(先用白色视标)沿弧架一端从周边向中心慢慢移动，随时询问受试者是否看到视标。当受试者回答已看见时，将视标向回移一段距离，再向中央移动，重复测试一次。待得出一致结果后，记下弧架上相应的经纬度，并及时标记在视野图纸(图5- 7- 2)上。同法从弧架的另一端测得对侧刚能看见视标的度数，并记在视野图上。

图5- 7- 2　视野图纸

5．将弧架顺时针转动45°，重复上述测定，如此继续，共测4次得到8个度数，将标在视野图纸上相应的8个点依次相连，便可得到白色视野范围。

6．按同样的方法，测出红、绿、蓝各色视野，用彩笔画在视野图纸上(测定时必须确定受试者报告的结果是色觉视力)。

7．用同法画出左眼的视野。

【注意事项】

1．测试过程中，受试眼应始终凝视弧架中心点，否则测出的视野不准确。

2．测试时，色标移动速度不宜过快。

【思考题】

为什么测出的正常人视野都不呈圆形?

［实验7．1．2］声波的传导途径

【目的】了解气传导及骨传导的途径，学习通过音叉试验鉴别感音性耳聋和传音性耳聋的方法。

【原理】声波经过外耳道引起鼓膜振动，再经听骨链和前庭窗膜进入耳蜗，这是声波传导的主要途径，称为气传导。声波也可以直接引起颅骨的振动，再引起位于颞骨骨质中的耳蜗内淋巴的振动，这种传导途径称为骨传导。骨传导的敏感性比气传导低得多，因此在正常听觉中的作用甚微。但当鼓膜或中耳病变引起气传导明显受损时，骨传导效应相对增强。

【实验对象】人。

【主要器材】音叉(频率256 Hz或512 Hz)、棉花。

【实验步骤】

1．比较同侧耳的气导和骨导( Rinne test，RT，任内试验)

( 1)室内保持安静，受试者背对检查者而坐。检查者振动音叉后，立即将音叉柄置于受试者一侧颞骨乳突部(骨导)，此时受试者可听到音叉振动的响声，随后声音逐渐减弱。

( 2)当受试者刚刚听不到声音时，立即将音叉移至同侧外耳道口约1cm处，则受试者应该又可重新听到响声。反之，先置振动的音叉于受试者外耳道口处，当刚听不到响声时，立即将音叉移到同侧颞骨乳突处，受试者应该听不到声响。

( 3)用棉球塞住同侧外耳道(模拟气导障碍)，重复上述实验步骤。

2．比较两耳骨传导( Weber test，WT，魏伯试验)

( 1)实验者振动音叉后，将音叉柄置于受试者前额正中发际处，注意两耳听到的声音强度是否相等。正常人两耳所感受的声音强度应基本相等。

( 2)用棉球塞住一侧外耳道，重复上述操作，询问受试者声音偏向哪一侧?

【注意事项】

1．室内必须保持安静，以免影响听觉效果。

2．振动音叉时用力不要过猛，可用手掌、橡皮锤或在大腿上敲击，切忌在坚硬物体上敲击，以免损坏音叉。

3．音叉放在外耳道口时，应使振动方向正对外耳道口，注意叉枝勿触及耳郭或头发。

【思考题】

1．正常人声波传导有哪些途径及特点?

2．如何鉴别传音性耳聋和感音性耳聋，两者表现有何不同?

(王铭洁)

实验7．2　人体血压、心脏和肺功能测定

［实验7．2．1］人体动脉血压的测定

【目的】了解间接测定动脉血压的原理;学习测定人体肱动脉的收缩压与舒张压的方法。

【原理】人体血压的测量部位通常为肱动脉。一般采用Korotkoff听诊法。通常血液在血管内流动时没有声音，如果血流经过狭窄处形成涡流，则可发出声音。当充气使缠缚于上臂的袖带内的压力加大，超过动脉收缩压时，肱动脉内的血流被完全阻断，从置于肱动脉受压段远侧的听诊器中听不到任何声音，也触不到桡动脉的脉搏，此后慢慢放气减低袖带内压，当其压力低于肱动脉收缩压而高于舒张压时，血液将断续地流过受压的血管，形成涡流而发出声音，此时即可在肱动脉受压段远侧听到声音，也可触到桡动脉脉搏。如果继续降压，当袖带内压等于舒张压时，则血管内血流由断续变成连续，声音突然由强变弱或消失。因此，刚能听到声音时的袖带内压相当于收缩压，而声音突变或消失时的袖带内压则相当于舒张压。

【实验对象】人。

【器材】血压计、听诊器。

【实验步骤】

1．熟悉血压计结构血压计由检压计、袖带和气球3部分组成。检压计是一个标有0～300 mmHg( 0～40 kPa)刻度的玻璃管，上端通大气，下端与水银储槽相通。袖带是一个外包布套的长方形橡皮囊，借橡皮管分别和检压计的水银储槽及气球相通。气球是一个带有螺丝帽的球状橡皮囊，供充气或放气之用。

2．测量动脉血压方法

( 1)让受试者脱去一臂衣袖，静坐桌旁5 min以上。

( 2)松开血压计上橡皮气球的螺丝帽，驱出袖带内的残余气体，然后将螺丝帽旋紧。

( 3)让受试者前臂平放于桌上，手掌向上，使上臂与心脏位置等高，将袖带缠在该上臂，袖带下缘至少位于肘关节上2 cm，松紧须适宜(图5- 7- 3)。

图5- 7- 3　动脉血压测定示意图

Korotkoff听诊法和触诊技术
上线为动脉血压搏动曲线，下线为声音记录曲线。

( 4)将听诊器两耳器塞入外耳道，务必使耳器的弯曲方向与外耳道一致。

( 5)在肘窝内侧先用手指触及肱动脉脉搏所在，将听诊器探头置于其上。

【观察项目】

1．测量收缩压　用橡皮气球将空气打入袖带内，使血压计上水银柱逐渐上升到触不到桡动脉搏动为止，继续打气使水银柱再上升20 mmHg( 2．67 kPa)，随即松开气球螺帽，徐徐放气，以降低袖带内压，在水银柱缓慢下降的同时仔细听诊，当突然出现“崩崩”样的第一声动脉音时，血压计上所示水银柱刻度即代表收缩压。

2．测量舒张压　使袖带继续缓慢放气，这时声音有一系列的变化，先由低而高，而后由高突然变低，最后则完全消失。在声音由强突然变弱这一瞬间，血压计上所示水银柱刻度即代表舒张压。血压记录常以收缩压/舒张压mmHg( kPa)表示。例如收缩压为120mmHg( 16．00kPa)，舒张压为76mmHg( 10．13kPa)时，记为120/76 mmHg( 16．00/10．13 kPa)。

3．触诊法　接触桡动脉脉搏来测定肱动脉的收缩压。操作与听诊法基本相同，所不同者系以手指先接触桡动脉脉搏，再用橡皮球打气使袖带充气，压迫肱动脉，直至桡动脉脉搏消失为止，再缓慢放气至开始出现脉搏时血压计上所示的刻度即代表收缩压。接触桡动脉脉搏测得的收缩压值比听诊法稍低，且此法仅能测出收缩压，不能测出舒张压。

【注意事项】

1．室内保持安静，以利听诊。

2．受测者必须静坐(有条件可平卧)，上臂必须与心脏处于同一水平。

3．袖带应平整地缠绕于上臂中部，松紧合适。

4．听诊器探头放在肱动脉搏动处，不可用力压迫动脉。

5．每次测量应在30 s内完成，否则将影响实验结果，且受试者将有手臂麻木感。重复测定时压力必须降到零后休息片刻再打气。

6．发现血压超出正常范围时，应让被测者休息10 min后复测。

［实验7．2．2］人体心电图的描记

【目的】初步学习人体心电图的描记方法，辨认正常心电图的波形并了解其生理意义，学习心电图波形的基本测量分析方法。

【原理】心肌在发生兴奋时有一定的程序，出现一系列的电位变化，这些电位变化通过心脏周围的组织和体液传导到全身。在体表，按一定的引导方法，把这些电位变化记录下来，所得到的图形就称为心电图。心电图对心搏起点的分析、传导功能的判断及房室肥大、心肌损伤的诊断有很大价值。

【实验对象】人。

【器材】酒精棉球、量规、心电图机。

【实验步骤】

1．心电图记录的操作步骤

( 1)接好心电图机的电源线、地线和导联线。打开电源开关，预热3～5 min。

( 2)受试者静卧检查床上，放松肌肉。在手腕、足踝和胸前安放好引导电极，接上导联线。为了保证导电良好，先用酒精棉球将放置引导电极部位的皮肤擦净。导联线的连接方法是红色——右手，黄色——左手，绿色——左足，黑色——右足(接地)，白色——胸前。调整心电图机放大倍数，使1 mV标准电压推动描笔向上移动10 mm，然后依次记录I、Ⅱ、Ⅲ、aVR、aVL、aVF、V1、V3、V5导联的心电图。取下心电图记录纸，进行分析。

2．心电图分析

( 1)波幅和时间的测量。

波幅:当1 mV的标准电压使基线上移10 mm时，纵坐标每一小格( 1 mm)代表0．1 mV。测量波幅时，凡向上的波形，其波幅应从基线的上缘测量至波峰的顶点;凡向下的波形，其波幅应从基线的下缘测量至波谷的底点。

时间:心电图纸的走速由心电图机固定转速的马达所控制，一般分为25 mm/s 和50 mm/s两种。常用的是25 mm/s，这时心电图纸上横坐标的每一小格( 1 mm)代表0．04 s。

( 2)在心电图记录纸上辨认出P波、QRS波群、T波和P- R间期、Q- T间期、ST段，进行下列项目的分析。

心率的测定:测量相邻的两个心动周期中P波与P波的间隔时间或R波与R波的间隔时间，按下列公式进行计算，求出心率。如心动周期之间的时间间距显著不等时，可将5个周期的P- P间隔时间或R- R间隔时间加以平均，取得平均值，代入公式

心电图各波段的分析:测量Ⅱ导联中P波、QRS波群、T波的时间和电压，并测定P- R间期和Q- T间期的时间。

［实验7．2．3］人体肺通气功能的测定

【目的】了解常用的肺通气功能的测定方法及肺的正常通气量。

【原理】肺通气功能测定是评定肺功能的指标之一。不同的呼吸参数能从各个侧面反映肺功能的情况。

【实验对象】人。

【实验器材】计算机、PowerLab信号采集器、呼吸盒、流量头、清洁管、咬嘴、鼻夹。

【实验步骤】

1．仪器连接见图5- 7- 4。

图5- 7- 4　仪器连接示意图

2．软件使用

( 1)软件启动　双击桌面上?图标进入Chart程序。

( 2)载入配置文件　单击工具栏上?图标，进入打开文件对话框，如图5- 7- 5所示。

图5- 7- 5　打开文件对话框

选择Spirometry．adiset，按“打开”按钮。程序进入空闲状态，如图5- 7- 6所示。

图5- 7- 6　呼吸量记录空闲窗口

其中通道1记录呼吸流速(原始信号) ;通道2记录肺容量。每次记录前必须调零，确保在没有流动气流时记录的流量信号为零，从而防止容积积分图的稳定漂移。调零步骤如下:进入Setup菜单的Channel Settings选项(图5- 7- 7)。

图5- 7- 7　调零步骤1

单击Channel 1的“Spirometer Pod”按钮(图5- 7- 8)。

图5- 7- 8　调零步骤2

在弹出的对话框中单击Zero调零(图5- 7- 9)。

图5- 7- 9　调零步骤3

3．受试者取舒适体位静坐于显示屏侧方，以避免心理因素的影响。衔好消过毒的咬嘴，夹鼻，用口呼吸。

4．启动记录。待受试者准备就绪，按下右下角的“Start”按钮开始记录。屏幕上出现呼吸流速和肺容量曲线。调整采样速率。

5．观察项目

( 1)潮气量　记录平静呼吸曲线约1 min。各次呼吸气量的平均值，即为潮气量( VT)。

( 2)深吸气量　在平静呼气之末做最大吸气时所能吸入的气体量，称为深吸气量( PIF)。

( 3)深呼气量　在平静吸气之末做最大呼气时所能呼出的气体量，称为深呼气量( PEF)。

( 4)用力肺活量(时间肺活量)　平静呼吸数次后，令受试者尽力作最大限度的深吸气，随即尽快作最大限度的深呼气，这一次最大限度的深呼吸气量，即为用力肺活量( FVC)。

( 5)用力呼气量　在作一次深吸气后以最快的速度呼出气体，在一定时间内所能呼出的气量，称为用力呼气量( FEV)。其中第一秒钟内呼出的气量称为1 s用力呼气量( FEV1)。通常以它所占用力肺活量的百分数来表示，即FEV1/FVC%。

6．测试过程　记录呼吸流速和肺容量曲线，选择一段待测呼吸曲线(图5- 7- 10)。

图5- 7- 10　呼吸流速和肺容量曲线

调用呼吸测量菜单的报告选项(图5- 7- 11)。

图5- 7- 11　呼吸测量菜单的报告选项

软件给出肺通气功能测定报告(图5- 7- 12)。

图5- 7- 12　呼吸量测定报告

调用呼吸测量菜单的数据窗口选项(图5- 7- 13)。

图5- 7- 13　调用数据分析窗口

数据窗口显示选定呼吸曲线的完整数据，灰色区显示用力呼吸(图5- 7- 14)。

图5- 7- 14　肺通气功能曲线报告

【注意事项】

受试者背对显示屏，以防人为因素干扰实验结果。

(王铭洁)

实验7．3　人体心率变异性分析

【目的】了解人体心率变异性( heart rate variability，HRV)的生理机制，增加对无创伤性检测方法的感性认识。

【原理】人体心动周期经常呈周期性波动。过去一直认为整齐的心率是健康心脏的指标之一，但现已认识到绝对整齐的心律是病态的。大量的研究工作证明，心率波动的频率特性分布能较客观地反映自主神经的功能状态，目前一般认为功率谱密度曲线中0．25 Hz (约4次心跳一周期)左右的高频成分( HF)与副交感神经有关(主要与呼吸运动有关)，而0．1 Hz(约10次心跳一周期)左右的低频成分( LF)则与交感及副交感神经均有关。

近年来，HRV分析作为一种反映迷走及交感活性的有效方法已被广泛应用于其他心血管和神经代谢疾病的研究中。

HRV分析是一种用于评价自主神经整合功能的非创伤性方法。可用来检查冠心病、糖尿病、肾功能衰竭等疾病患者自主神经的损害程度，对某些疾病的诊断与预后有较重要的参考价值。HRV分析还可用于评判疲劳、衰老的程度，在专业择员和老年病防治等方面均有较大用途。

详细原理见附录。

【实验对象】人体。

【实验步骤】

1．实验装置连接见图5- 7- 15。

图5- 7- 15　实验装置连接

第一通道接心电图导联，采用肢体导联或胸导联;第二通道接脉搏换能器;第三通道接呼吸换能器。呼吸换能器可采用电阻带(胸式)换能器。图5- 7- 16为心电图导联和脉搏换能器放置方法照片。

图5- 7- 16　心电图导联和脉搏换能器放置方法

2．运行“BRS200”程序程序功能通过菜单或快捷工具栏选择。快捷工具栏(图5- 7- 17)与MFLab200基本相同，增加的功能按键有:去除期前收缩、显示RR间期曲线、显示谱密度曲线、显示相干函数曲线、显示轨迹图和直方图、显示分析结果等。

图5- 7- 17“BRS200”　程序快捷工具栏

( 1)信号采集　程序界面见图5- 7- 18。

图5- 7- 18“BRS200”　程序采样界面

实验控制与MFLab200相似，请参见第四章第一节第三部分“MFLab200功能学科实验软件包”使用说明。

调节放大器增益，观察心电波形，如R波与其他波群在幅度上区别不大，可改变心电导联。调节第一通道检测阈值，使R波准确检出。

( 2)分析参数设置　在弹出的对话框中设置有关参数。可设置的参数包括: RRI序列长度、相干函数阈值、AR模型最大阶数、直方图Bin、时窗函数、谱成分范围等。

参数设置对话框见图5- 7- 19。

图5- 7- 19　参数设置对话框

( 3)去除期前收缩　在“显示R- R间期曲线”页面时有效。单击工具栏上“去除期前收缩”按钮，程序以特定判别标准识别RRI序列中的期前收缩和干扰，并予以删除。可多次应用该功能，直至期前收缩和干扰消失。如出现RRI序列严重失真，可使信号复原。

( 4)计算结果显示　单击工具栏上相应按钮，选择R- R间期曲线、谱密度曲线、相干函数曲线、轨迹图和直方图或分析结果等显示页面，如图5- 7- 20为程序计算得到的有关曲线。

图5- 7- 20　程序计算得到的有关曲线

A为RRI曲线; B为RRI序列的谱密度曲线; C为RRI序列的轨迹图; D为RRI序列的直方图

3．观察安静时和活动后HRV各项指标的变化。

［附］心率变异性( HRV)分析的原理和应用

人体心血管、胃肠道、支气管、汗腺及胰岛、甲状腺、肾上腺等内分泌腺体功能均受自主神经的调节。许多疾病可造成自主神经的损害和功能失调，而自主神经的损害和功能失调又是许多疾病的发生原因之一。因此，准确地测定人体自主神经的功能，对疾病的辅助诊断、预后估计和疗效评价均有重要意义。过去由于缺乏简便、有效的测定工具，人体自主神经功能测定很难在临床上开展。

我们研制成功的“心率变异性频谱分析仪”具有功能多、参数齐全和操作方便等特点，可快速、准确地测定人体自主神经功能，为临床医生提供了十分有用的测定手段。

(一) HRV分析的机制与临床应用

HRV是描述心脏节律性变化的重要指标，由于HRV可反映自主神经的功能状态，因而HRV测定在科研和临床均有重要用途。

从心电图来看，其R- R波的间距并非固定，而是有一定的变异。第一种是呼吸性变异，也就是在吸气时交感中枢兴奋、心率较快、R- R间距较小;呼气时迷走中枢兴奋、心率较慢、R- R间距较大，这就是所谓的窦性心律不齐。在小儿较明显，成年人就不太明显，老年人更不明显。由呼吸所引起的波动，其频率在0．25 Hz左右，即每4次心跳有一次周期性波动(当呼吸为12次/分，心率为60次/分时，波动频率为0．25 Hz。如心率或呼吸节律发生变化，波动频率也发生相应变化)。第二种是交感中枢放电节律的变异，在血压波中的所谓Meyer's波就是这种变化。交感中枢的放电频率为6～8 Hz，但不是均匀的而是经常有波动。如6次/分波动，而心率为60次/分，则这种波动约为0．1 Hz。20世纪70年代Sayers利用功率谱方法首先记录了心率波动的频率特性分布。近来Lumbardi等在动物实验中观察到心交感神经具有与LF相同的发放变异，故认为LF主要与交感活动有关。

我们在氨基甲酸乙酯-氯醛糖麻醉兔的实验中看到，在微量注射兴奋性氨基酸DLH( 0．2 M)至下丘脑室旁核致血压、心率上升过程中，HRV的总变异性( TV)、LF 与HF均明显升高，但TV、LF和HF的变化与血压、心率水平的高低无关。提示HRV的变化反映交感迷走神经的活动变化而非其紧张性高低。进一步在家兔与大鼠的实验中发现，动物脑缺血、缺氧，或麻醉药等均可使TV明显下降;而刺激主动脉弓减压神经、疑核或迷走神经离中端降低心率与血压时，TV与HF均增加，LF也有所增加。刺激中脑中央灰质背侧、延髓头端腹外侧致升压和心率加快时，TV 与LF均明显增加，HF有所减少。这在用间断性刺激、频率接近0．1 Hz时最为明显。提示TV反映自主神经中枢的整合功能，LF主要反映交感中枢活动，而HF反映迷走中枢活动，LF/HF反映交感与迷走中枢活动何者占优势。

在人体的观察表明体位改变、运动及情绪等均对心率变异性频谱有影响，并可用体位变化反应等来评判自主神经的调节功能。我们在160余名不同年龄( 4～80岁)、男女性各半的健康人观察到从幼儿到10多岁的青少年期TV逐渐增高，至20多岁的青年期达最高峰，过30岁后TV有较大幅度的降低，以后逐年缓慢下降。女性50岁后，男性60岁后TV明显低于青年期。但健康人即使年逾70岁，TV仍维持在一定水平。

HF也从幼儿期的低水平逐渐增高，至20多岁的青年期达最高峰，以后逐渐下降，至50岁后明显下降，然后维持在一定水平。

LF从幼儿期开始也逐渐升高，30岁以后明显升高，女性50岁后，男性60岁后达最高峰。

与此相应，LF/HF从幼儿期开始逐渐下降，至20多岁的青年期达最低值，然后又随年龄增长而逐渐回升，至70多岁时为最高。这些结果反映了健康人自主神经整合功能及交感迷走神经活动在不同年龄时的变化，为了解健康人自主神经功能的发育发展和衰老过程提供了重要理论依据与客观指标。我们所调查的不同年龄的正常值也为HRV的临床应用提供了判断标准。

临床研究证实冠心病、心绞痛、心肌梗死、心脏性猝死、充血性心力衰竭等患者HRV明显低于正常人，心肌梗死后心律失常事件及心源性死亡率与HRV降低程度显著相关。HRV与心脏功能、晚电位、电生理检查等组合可大大提高对心肌梗死患者近期和远期危险分层的可靠性。

近年来，HRV分析作为一种反映迷走及交感活性的有效方法已被广泛用于其他心血管及神经代谢疾病的研究中。复旦大学附属华山医院肾病科曾观察到慢性肾功能衰竭病人HRV中TV、HF、LF均明显低于健康人，血透后有明显改善。内分泌科也观察到糖尿病患者的HRV中TV等指标降低，反映了这些患者自主神经整合功能受到损害。

我们在与中医药大学附属龙华医院的合作研究中看到脑梗死病人HRV中TV大多明显降低，针刺双侧足三里可明显提高TV，减慢心率。我们在与华山医院心血管科的合作研究中也看到冠心病患者HRV中TV大多数明显降低，针刺双侧内关可缓解心绞痛，并明显提高TV。研究证明HRV测定在判断脑梗死、心绞痛等病人的自主神经功能状态、预后及针刺疗法效果等均有一定价值。

实践表明HRV分析是一种较新的、敏感而可定量的，可用于评价自主神经整合功能的非创伤性方法，对判断患者的中枢功能状态、提高对冠心病等的治疗水平、评估预后、及时进行药物干预等方面均有重要价值，同时将HRV分析与冠脉造影等检查进行相关分析，有利于明确HRV分析的临床价值，有助于降低医疗成本。HRV分析法可用来检查糖尿病、肾功能衰竭等疾病患者的自主神经损害程度，作为诊断与预后的重要依据。HRV分析法还可用于评判疲劳、衰老的程度，在专业择员和老年病防治等方面均有较大用途。

目前HRV分析主要依赖计算机来完成，计算机对采集到的心电R- R间期( RR interval，RRI)数据进行处理以得到各种参数，根据处理方法的不同，可将HRV分析方法大致分为时域分析和频域分析两大类。

时域分析根据RRI的离散程度来评判心率波动的大小，它的缺点是不能准确地区分交感神经和迷走神经活动的强弱变化。频阈分析能对RRI功率谱中的各频率成分做定量分析，从而弥补了时域分析的不足。时阈分析和频阈分析的综合运用，能较为客观地评判自主神经系统的功能状态。

常用的分析方法和主要参数如下。

1．时域分析( time- domain analysis，TDA)

( 1)简易测量法　利用最长RRI和最短RRI的差来作为HRV的指标。如用于胎儿心率和甲减的研究。

( 2) RRI的方差和标准差( standard deviation，SD)　RRI数据一般为256个或512个，也可以长达24 h。正常人24 h SD通常＞50 ms。

( 3) SD的变异系数( coefficient of vari- ation，CV)　CV可排除被测者固有心率的差异，增加可比性。

( 4) R- R间期跳跃指数　求出相邻RRI的差值，按每小时计算出超过某一预定值(一般50 ms)的RRI频数，并绘制曲线，曲线波动代表迷走活动。

( 5) HRV指数　某一时间内RRI总数目/占比例最大的RRI的数目。正常人通常＞25。

2．频域分析( frequency- domain analysis，FDA)　获取一定长度的RRI数据，采用快速富立叶变换( fast fourier transform，FFT)或自回归模型( autoregressive，AR)，求出功率谱密度( power spectrum density，PSD)，继而计算出各频率成分的绝对值和标准化单位。

AR较之FFT算法具有较高的分辨率，AR有Burg、Marple等递推算法。

( 1)谱估算方法谱密度( PSD)估计用最大熵谱估计法，这种算法是一种信号参数的AR估算法AR表达为:

X( t) = a( 1) X( t－1) + a( 2) X( t－2) +…+ a( p) x( t－p) + e( t)

其中e( t)为预测误差，a( p)为待定系数。

P阶AR模型的系统传递函数为:

PSD可由下式求得:

( 2) AR阶数P的选择阶数过低则各谱成分分辨率降低，阶数过高则会出现谱分裂。合适的阶数可根据有关法则决定，如Final Prediction Error法则( Akaike，1970)。

( 3)参数的标准化处理

1)谱成分绝对值根据以下关系求得:

SD =∫PSD2

2)谱成分标准化单位( normolized unit，NU)根据以下公式求得:

LF( HF) = LF( HF) / ( PSD曲线总面积－DC )×100

3)频率的标准化处理常用的有两种方法:

( a) F( Hz) =1 000×F( beat/cycle) / mean of RRI

( b) RRI数据序列按时间插值再计算PSD。

( 4) LF和HF的划分低频( 0．03～0．1 Hz)，中频( 0．1～0．2 Hz)，高频(根据呼吸频率决定)。

3．其他观察方法

( 1)直方图　求出TV、10%TV、50%TV等。

( 2)相平面图(轨迹图)。

(二)健康人安静时HRV各参数正常值调查结果

我们通过调查发现，幼儿期至30多岁的健康人安静时HRV参数随年龄呈缓慢变化的过程，40岁以后的健康人安静时的HRV参数也随年龄呈缓慢变化的过程，因而我们以40岁为界，分两组求得HRV各参数的统计值。

( 1)　＜40岁组

TV　( 2 324．00±1 551．11) ms2( M±SD)

LF/HF　( 0．663 4±0．549 4) ( M±SD)

( 2)　≥40岁组

TV　( 1 397．35±672．81) ms2( M±SD)

LF/HF　1．343 2±1．088 8( M±SD)

(三) HRV测定的适用范围

( 1)冠心病、心绞痛、高血压、充血性心力衰竭、心肌梗死、心肌病、心脏性猝死的预测等。

( 2)糖尿病。

( 3)甲状腺功能亢进或减退。

( 4)肾功能衰竭、血透前后的疗效观察。

( 5)脑缺血、脑卒中(中风)后。

( 6)支气管哮喘。

( 7)少儿低能、多动症。

( 8)早衰、阿尔茨海默病(老年性痴呆)。

( 9)药物与毒物中毒对自主神经的影响。

( 10)中医辨证施治的重要参考指标。

( 11)飞行员、汽车和火车司机疲劳程度的测定。

( 12)运动员竞技状态的评判。

(曹银祥)

第八节　其他实验

实验8．1　药物半数致死量( LD50　)的测定

【目的】学习和理解药物半数致死量( LD50)的概念、测定方法及计算。

【原理】药物效应按性质不同，分为量反应和质反应两种类型。药物效应指标在原来基础上可用数量增减来表示的称为量反应，例如血压的升高、血糖的降低等。药物效应指标用有或无来表示的则称为质反应，例如存活或死亡、阳性或阴性等。质反应实验通常将动物均匀分组，各组给予不同的剂量，观察各组内发生质反应动物数的百分率。在一定的剂量范围内，各组的反应率将随剂量的加大而递增。

将横坐标代表剂量、纵坐标代表反应百分率绘图，通常可绘制成一条长尾“S”形曲线。如果将剂量转换成对数剂量，这一曲线就变成一条对称的“S”形曲线。将反应百分率转换成概率单位后，则它和对数剂量的关系就是一条直线(图5- 8- 1)。在死亡百分率50%所对应的剂量即为LD50。反应百分率和概率单位之间的转换关系可查阅概率单位表。

常用治疗指数( therapeutic index，TI)来衡量药物的安全性，TI值越大，安全性越高。TI = LD50/ED50。用药的目的是希望药物对所有病人产生最高疗效而不发生毒性，TI不能准确地表示最大效应时的毒性或大多数病人有效剂量( ED95)与少数病人开始出现中毒死亡剂量( LD5)之间的差距。特别是有效的量效曲线和死亡的量效曲线不平行时，用TI来表示药物的安全性就会出现偏差，此时，可用安全范围( margin of safety)来评价药物的安全性。安全范围= LD5/ED95或LD5～ED95的剂量距离。

LD50的计算方法有许多种，其中以Bliss法最为严谨，结果最精密，称之为概率单位正规法，申报新药一般采用此方法。本实验介绍较为常用并且计算方便的改良寇氏法。

【动物】小鼠10只，体重20 g左右。

【药品与器材】不同浓度( 1．108%，1．477%，1．969%，2．625%，3．5%)的普鲁卡因溶液，5%苦味酸;天平，1 ml注射器，鼠笼。

【实验步骤】

图5- 8- 1　药物的剂量效应曲线

A．在普通坐标时的量效曲线; B．横坐标为对数刻度时的量效曲线; C．横坐标为对数刻度，纵坐标为概率单位刻度的量效曲线

1．分组　小鼠称重，分为5组，每组2只。

2．用药　各组分别腹腔注射5种不同剂量的普鲁卡因溶液。

3．观察、记录结果观察2 h内每组动物中毒症状，记录死亡数。汇集结果，求LD50。

全班实验结果记入下表(表5- 8- 1)。

表5- 8- 1　小鼠给药剂量与死亡数统计表

4．数据处理按以下公式计算LD50:

式中:

Xm=最大剂量对数值

P =动物死亡率(用小数表示)

∑P =各组死亡率总和

I =相邻两组剂量比值的对数(高剂量做分子)

将实验结果代入上述公式，求得:

【注意事项】

1．要准确称取小鼠的重量。

2．抽取药液要准确。

3．腹腔给药时不能漏液。

【思考题】

1．在目前新药研制过程中，为何都要测定LD50?

2．设有同类药物A和B，已知A药的LD50为50 mg/kg，ED50为5 mg/kg，B药LD50为40 mg/kg，ED50为2 mg/kg，问哪个药物较安全?

(杨素荣)

实验8．2　水杨酸钠半衰期的测定

【目的】学习药物半衰期的测定和计算方法及有关的基本概念，并了解半衰期的临床意义。

【原理】

1．基本概念

( 1)房室模型　药动学将身体模拟为由若干“房室”组成的系统。最常见的为一室与二室模型。其划分主要依药物分布于不同组织的速率而定。

1)一室模型药物入血后立即均匀分布于全身各器官组织，则为一室模型。给药后logC- t曲线为一直线，只有消除相(此时分布相忽略不计)。此种模型计算简单，多次给药或血管外给药时用此法计算对临床用药通常误差不大。

2)二室模型药物入血后如以两种速率分布，即药物从血液分布到血流丰富的组织器官(肝、肾、心、肺、肾上腺等)很快，而分布到血流贫乏的组织器官(脂肪、骨、静态肌肉等)则很慢，为二室模型。可把血液和血流丰富的组织归入中央室，而把血流贫乏的组织归入外周室。给药后，logC- t曲线表现为两个时相，前部较陡为分布相(α相)，后部较平为消除相(β相)。静注给药时，多数药呈二室模型(分布相取血时间应较密)。

( 2)零级动力学与一级动力学

1)零级动力学是指血药浓度按恒定消除速度(单位时间内消除的量)进行消除，与血药浓度无关，也称为定量消除。多数情况下，是体内药量过大，超过了机体最大消除能力所致。

2)一级动力学是指血中药物消除速率与血中药物浓度成正比，血药浓度高，单位时间内消除的药量多，当血药浓度降低后，药物消除速率也按比例下降，也称为定比消除。绝大多数药物都按一级动力学消除。

( 3)血浆半衰期( t1/2)t1/2是消除相血浆药物浓度下降1/2所需要的时间。表明药物在体内消除的快慢，从总体上反映消除器官(肝、肾等)的功能。临床上主要与估算给药间隔时间有关。

2．水杨酸钠的测定原理水杨酸钠在酸性环境中成为水杨酸，与三氯化铁生成一种络合物成紫色。该络合物可在520 nm产生吸收峰，此时的光密度值与浓度成正比。

【动物】家兔，3 kg左右。

【药品与器材】10%水杨酸钠，0．02%水杨酸钠标准液，10%三氯醋酸，10%三氯化铁，0．1%肝素生理盐水，1%普鲁卡因，蒸馏水; 5、10 ml注射器，兔手术台，手术器械，干棉球，试管( 10 ml)，离心管( 10 ml)，试管架，离心机，752型分光光度计。

【实验步骤】

1．取离心管6支，编号1～6，各管均加入10%三氯醋酸3．5 ml。

2．取家兔一只，仰卧位固定于手术台上。剪去颈前区被毛，于皮下注射1%普鲁卡因溶液1～2 ml，局麻后分离一侧颈外静脉，并于其下方穿一根细线，供采血时固定静脉用。

3．用0．1%肝素生理盐水润湿的5 ml注射器，从分离出的颈外静脉采血2．0 ml，分别注入1号离心管(对照管)和2号离心管(标准管)各1．0 ml，摇匀静置，用干棉球轻压针孔处以防出血。

4．从取血对侧的耳缘静脉注射10%水杨酸钠2 ml/kg，准确记录给药完毕的时间。在给药完毕后的第5、10、30和45 min各取血1 ml，分别置于3、4、5和6号离心管内，摇匀静置(每次采血后要洗净注射器，以肝素生理盐水润湿备用)。

5．取0．02%水杨酸1 ml，注入2号管内，其余各管加1 ml蒸馏水，摇匀。

6．将各离心管以2 500 r/min，离心5 min。准确吸取上清液3 ml于干净试管中，分别加入10%三氯化铁0．5 ml，摇匀显色。

7．在分光光度计520 nm波长下，以1号管为对照测定其余各管的光密度值。

8．结果与处理药物经快速静注后，一室模型的药物血药浓度的衰减速率始终一致。当以药物血浓度的对数为纵坐标，时间为横坐标作图时，其时量关系曲线呈一直线。

由标准管的光密度值( Y)浓度( X)求得比值K，K =X。再根据X = K·Y，由

Y Y1、Y2、Y3、Y4求得X1、X2、X3、X4。以4个lgX值为纵坐标，相应的取血时间为横坐标作时量关系曲线。在曲线上任取两点的坐标代入如下公式计算t1/2

表5- 8- 2　水杨酸钠半衰期的测定

【注意事项】

1．采血量要准确。每次吸取血样及滤液时，必须更换吸头。

2．以开始采血时间作为血样本时间，若未能按时采血，则以实际采血时间参数计算。

3．注射水杨酸钠溶液时动物会有挣扎，注意固定兔头，但不要掐住耳缘静脉根部而影响进药。

4．给离心管、试管编号时应同时编上组号和管号，以防止离心时混淆。

【思考题】

1．测定药物代谢动力学参数对临床药物的使用有何意义?

2．零级、一级动力学中t1/2计算方式是否相同?为什么?

(徐昕红)

实验8．3　纳洛酮的催促戒断反应及药物的预防

【目的】观察纳洛酮对吗啡依赖性小鼠的催促戒断症状作用及药物的预防。

【原理】滥用阿片类麻醉药品可产生依赖性，主要表现为身体依赖性。一旦停药即可出现痛苦异常的戒断症状。使用纳洛酮可使戒断症状出现更早、更剧烈，称为“催促戒断反应”。现在普遍认为阿片类戒断症状的出现与脑内蓝斑核的异常放电有关。中枢α2受休激动剂可乐定通过抑制此核异常放电而改善阿片类的戒断症状。

【动物】小鼠(雄性) 3只，20～25 g。

【药品与器材】0．2%吗啡注射液，生理盐水，4%可乐定，0．06%纳洛酮，苦味酸溶液; 1、2 ml注射器，高型玻璃钟罩或圆形塑料桶(高35 cm，直径16 cm)。

【实验步骤】

1．两日递增法建模　取小鼠3只，编号甲、乙、丙，分别为正常对照鼠、吗啡依赖模型鼠、可乐定预防鼠。称记体重后按表5- 8- 3方案，腹腔注射给药，建立吗啡依赖小鼠模型。小鼠仅自由饮水、进食，每日称体重。

表5- 8- 3　两日递增法给药方案

2．催促戒断症状　完成7次给药后，各鼠于第二天13: 00腹腔注射0．06%纳洛酮0．1 ml/10g催促戒断反应，注意丙鼠于纳洛酮催促前30 min腹腔注射4%可乐定0．1ml/10g。注射纳洛酮后，立即放入高型玻璃钟罩或圆形塑料桶中，观察记录20 min内小鼠跳跃次数(以小鼠四爪离地为1次)，并观察小鼠活动状况(如呼吸急促、洗脸、腹泻、颤抖等)。

3．统计实验结果　将全实验室的结果集中统计，用t检验进行统计学处理，分析药物是否具有显著的预防作用。

表5- 8- 4　纳洛酮的催促戒断反应及药物的预防

【注意事项】

纳洛酮的作用时间短，戒断症状的观察应在纳洛酮注射后30 min内进行。

【思考题】

何谓药物依赖性?哪些药物最容易形成依赖性?应如何预防?

(徐昕红)

第九节　自行设计实验

传统的、常规的实验教学是以教材为中心的，教师的教学和学生的学习都以是否达到教材内容或教学大纲的要求为目的。学生的学习是处在被动状态的，学生在教师指定的框架中“照葫芦画瓢”地进行实验，只有这样才能得到教学所要求的结果。尽管这样的教学方式能够使学生学到教学所要求掌握的知识，然而，学生的学习潜能和创新性思维的发挥却被束缚了，在当今这个科学发展日新月异的时代是极不适应的。

开设自行设计实验的目的是要改变学生被动学习的状态。通过自行设计实验可以充分调动学生的主观能动性，挖掘学生的学习潜能，激发学生的创造性思维和能力，启蒙学生的科研意识;在老师的必要指导下，以学生为中心，以问题为基础去探索和解决未知的问题，独自完成从提出问题→确立题目→实验设计→完成实验内容→结果总结分析→成文汇报的全过程。在整个自行设计实验的过程中，学生会遇到很多预想不到的问题和困难，在解决这些问题和困难的过程中，学生会得到很好的磨炼和升华，取得课堂教学所得不到的效果。

自行设计实验的基本步骤分述如下。

一、立题

1．提出问题　根据自己的兴趣或对事物的观察提出要解决的问题，初步确立要研究的题目。

2．提出假设　针对问题或疑问，假设问题可能发生的原因是什么或用什么方法解决问题。

3．查阅文献　根据假设，凭借已学的知识查阅相关文献，深入了解问题所涉及的相关专业知识和国内外的研究现状，从中获得对自己观点的支持与否和解释。

4．确立题目　在假设是基本可信的基础上，通过集体讨论酝酿，确立一个既有科学性又有一定新意、具有可操作性的题目。题目不可过大(即研究内容不可过多)。

二、实验设计

题目确立后，实验设计是极重要的一环。

(一)实验设计的基本内容和步骤

1．围绕研究目的明确实验要解决的问题。

2．确定研究对象及其数量。

3．确定处理因素(干预措施)。

4．确定实验的观察指标。

5．明确实验方法和实验次序。

6．明确实验误差的控制方法。

7．确定实验数据的收集方式。

8．确定数据整理和统计分析方法。

(二)医学实验研究的基本要素

1．受试对象　受试对象( object)又称研究对象，是处理因素作用的客体，实际上他(它)所代表的就是根据研究目的而确定的观察目标总体。应明确规定受试对象的纳入标准和排除标准，以保证他(它)们的同质性，并从可行性、依从性、对处理因素的敏感性及伦理等方面综合考虑受试对象的选择确定。

2．处理因素　处理因素( treatment，study factor)是根据研究目的施加于受试对象的外界干预。

确定处理因素应注意:

( 1)分清处理因素和非处理因素(混杂因素)。

( 2)明确主要的处理因素和非处理因素。

( 3)保持处理因素恒定不变，即处理因素的标准化。

3．实验效应　实验效应( experimental effect)是处理因素作用于受试对象的反应和结局，它通过观察指标来体现。选择确定观察指标应注意以下几个方面。

( 1)关联性　指标应与研究目的有本质的联系，能确切反映处理因素的效应，且数量要适当。

( 2)客观性　客观指标是借助测量仪器和检验等手段来反映的观察结果，具有较好的真实性和可靠性。主观指标往往是人为的定性判断，易受心理因素影响。应尽量选择客观的、定量的指标作为实验效应指标。

( 3)指标的准确度和精密度　准确度( accuracy)指观察值与其值的接近程度，受系统误差的影响;精密度( precision)指重复观察时，观察值与其均数的接近程度，受随机误差的影响。对准确度和精密度都要有控制标准。

( 4)指标的特异性和敏感性　特异性( specificity)反映指标鉴别真阴性的能力，敏感性( sensitivity)反映其检出真阳性的能力。高特异性和高敏感性是指标可用性的体现。

(三)实验设计的基本原则

1．对照原则正确　设立对照组可控制实验过程中非实验因素的影响，减少实验结果的偏差，从而使处理因素的效应充分地显露出来。因此，实验设计时应遵守对照原则( principle of control)。

对照的类型:

( 1)空白对照( blank control)　不给对照组的受试对象任何处理，其他实验条件与实验组相同。

( 2)标准对照( standardized control)　用现有的标准值或正常值作对照。

( 3)自身对照( self control)　同一受试对象既作对照者，又作实验者接受处理，即对照和处理在同一受试对象身上进行。

( 4)实验对照( experimental control)　采用与实验组操作条件一致的对照措施。

( 5)安慰剂对照( placebo control)　采用一种无药理作用的物质，其剂型或处置不为受试者识别，称为安慰剂。

2．随机化原则　随机化原则( principle of random)是用随机的方式将处理分配给受试对象，使每个对象分到实验组与对照组的机会相同。随机化是保证非处理因素在组间达到均衡一致的重要手段之一，也是用统计方法进行资料分析的基础。

常用的随机化方法有抽签、计算(器)机产生随机数、使用随机数字表和随机排列表等。

3．重复原则　重复原则( principle of replication)是指处理组与对照组的受试者应具有一定的数量，即应有一定的样本含量( sample size)。重复的主要目的是避免偶然现象的影响，正确估计实验误差，并将其降低到最低限度。

样本量的确定要考虑研究目的、研究条件、实验的误差控制要求等多方面因素，事先应确定容许的第Ⅰ类错误和第Ⅱ类错误的概率，并对总体标准差及两总体参数差异的大小等有所了解。

(四)常用的实验设计类型

1．完全随机设计　完全随机设计( completely randomized design)又称为简单随机分组设计，它是将同质的受试对象随机地分配到各处理组，再观察其实验效应，并进行两个样本或多个样本间效应指标的比较。

优点:设计简单，易于实施。

缺点:实验效率低，只研究一个处理因素。

统计分析方法: t检验、方差分析或秩和检验。

2．配对设计　配对设计( paired design)是将受试对象按一定的条件或某些特征(非处理因素，如年龄、性别、体重等相近的两个对象)配成对子，再将每对中的两个受试对象随机分配到不同处理组。配对设计可增强处理组间的均衡性，减少随机误差，提高实验效率。

形式:自身配对、同源配对、条件相近者配对。

优点:处理组间可比性好，抽样误差小，所需样本含量较小。

缺点:当配对条件严格时，不易达到要求。

统计分析方法:配对t检验或wilcoxon符号秩和检验。

3．交叉设计　交叉设计( cross- over design)是一种特殊的自身对照设计。以两阶段交叉设计为例，每个受试对象可以是两个时间段分别接受A、B两种处理。随机将受试对象等分为两组，第一组受试对象的处理顺序是先A后B，另一组受试对象的处理顺序相反，即先B后A。因为两种处理方式在研究过程的两个阶段中交叉进行，故又称为交叉设计。

优点:平衡实验顺序的影响，将实验方法之间的差别、时间先后和受试者之间的差别区分开来，节约样本量。

缺点:要求无残留效应，应用受到一定限制。

统计分析方法:方差分析或秩和检验。

4．随机区组设计　随机区组设计( randomized block design)是配对设计的扩展(处理数＞2)，又称配伍组设计或随机单位组设计。先按影响实验结果的非处理因素相同或相近的原则将受试对象配成区组( block)，再分别将各区组内的受试对象随机分配到各处理组或对照组。区组受试对象数取决于处理组数，区组数取决于各处理组的实验对象数。

优点:处理组间均衡性好、实验误差小、实验效率高。

缺点:区组内实验对象数与处理数相同，处理数不能过多，至多不超过20个，最好在10个左右。因处理数多，区组必然增大，局部控制的效率降低。

统计分析方法:方差分析。

5．析因设计析　因设计( factorial design)是将两个或多个因素的各个水平进行排列组合，交叉分组进行实验，用于分析各因素间的交互作用、比较各因素不同水平的平均效应和因素间不同水平组合下的平均效应，寻找最佳组合。

优点:可揭示存在的交互作用，全面高效。

缺点:当因素较多时，所需实验单位和处理数剧增，工作量大。

统计分析方法:析因设计的方差分析。

6．正交设计　正交实验设计( orthogonal experimental design)是研究多因素多水平的又一种设计方法，它是根据正交性从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验，这些有代表性的点具备了“均匀分散，齐整可比”的特点。正交设计与析因设计相比大大减少了实验次数，是一种高效率、快速、经济的实验设计方法。日本著名的统计学家田口玄一将正交试验选择的水平组合列成表格，称为正交表。例如作一个三因素三水平的实验，按全面实验要求，须进行33=27种组合的实验，且尚未考虑每一组合的重复数。若按L9( 33)正交表安排实验，只需作9次，显然大大减少了工作量。由于用特定的表格进行设计，只要了解它的性质，能正确选定正交表，就可达到应用目的，很容易掌握。因而正交实验设计在很多领域的研究中已经广泛应用。

优点:适合多因素多水平的实验，节省实验次数，设计简单，分析可靠。

缺点:当因素的水平不同时，没有现成的正交表可以选用，在正交设计时会增加一定的难度，因而在使用正交实验设计法时选择合适的正交表是很重要的。

统计分析方法:直观分析，方差分析。

(五)确定样本量

确定适当的样本量，既可以节约资源，又能控制实验误差，取得准确的研究结果。

1．确定样本量的条件

( 1)设定检验水准(显著性水平)，即第Ⅰ类错误概率α。这就是希望在α=0．05的水准上发现差别，还是希望在α= 0．01的水准上发现差别。α取值越小，所需样本n越大。如无特殊，一般取α=0．05或α=0．01。同时还应明确是单侧还是双侧检验。

( 2)设定检验的第Ⅱ类错误概率β或检验效能1－β。1－β的意思是:如果两组确有差别，则在每100次实验中平均能出现差别的概率。一般要求1－β≥0．75。1－β越高，则所需例数越多。

确定检验水准和检验效能，实际上是如何确定假设检验时犯第Ⅰ类错误的概率α和犯第Ⅱ类错误的概率β，α、β的大小应根据第Ⅰ类错误和第Ⅱ类错误的危害性来决定。以新药疗效论证的临床试验为例，第Ⅰ类错误是将疗效与对照药本无差别的新药误认为比对照药的疗效好，第Ⅱ类错误是将疗效优于对照药的新药误认为与对照药的疗效相同。如果新药的生产成本低于对照药，且不良反应比对照药小，不妨将α和β定得小一些，如α=0．01，β=0．05。反之，若新药的生产成本高于对照药或不良反应比对照药大，应将α和β定得略大一些，如α= 0．05，β=0．2。检验效能1－β就是优秀药物经过实验被发现的概率。当研究者倾向接受H1(有效假设)时，1－β应取较大的值，如0．95，0．99。

( 3)处理组之间的差别δ(容许误差)的估计，可通过预实验或根据专业知识估计。处理组之间差别δ越小，则需要的样本量越大。

( 4)总体标准差σ、总体率π、总体均数μ的估计，可根据预实验、查阅文献或专业知识判断。σ越大，则需要的样本量越大。

单侧检验所需的样本量少于双侧检验的样本量。

2．常用样本量估计方法

( 1)样本均数与总体均数的比较(或配对比较)

其中，n为每组的样本含量，配对比较时，n为对子数。σ为总体标准差的估计值，配对比较时为差值的总体标准差的估计值。α有单双侧之分，β只取单侧。

( 2)两样本均数比较

( 3)样本率与总体率的比较(大样本)

π0是已知总体率，δ=π0－π1。

( 4)两样本率比较，当例数相等时

式中p1、p2为两总体率的估计值，sin－1的单位为弧度。

三、写实验方案

根据实验设计的框架书写实验方案。实验方案的内容和格式如下。

1．题目，设计者(组员)，班级。

2．立题依据　立题的理由，实验的目的和意义，欲解决的问题和国内外研究现状。

3．研究内容、方法和技术路线　研究哪些项目，设立哪些观察指标，采用什么方法，并阐述其理由，整个实验进程的安排。

4．预期结果　立题时所期望得到的结果。

5．可能遇到的困难和问题及解决措施预先设想好实验中可能会遇到的问题和困难，并安排好和列出解决预案。

6．动物、药品、器材的详细预算

( 1)动物　品种、性别、体重、数量、使用时间。

( 2)药品　规格(即药品的单位剂量，如mg/ml、mg/片等)、剂型(如针剂、片剂、粉剂)和使用总量。

( 3)器材　型号、规格和数量。

( 4)联系人及联系方式(电话)。

四、审阅方案

写好的方案上交后，由相关学科的老师从科学性、创新性和可行性等方面对方案进行审阅，并写出书面意见;不合格的方案将被要求重写或被取消。

五、修改方案

根据老师提出的意见，对方案进行修改并向指导老师汇报修改的结果，征得老师的意见后，再对方案作进一步完善。

六、实验准备

学生根据实验内容和预算上所列物品清单，开出借条提前向指定实验室的管理老师领取所需的药品及器材等，并在实验开始前按要求做好药品、试剂的配制和动物的预处理。

七、预实验

学生可利用实验课时间，也可另行安排时间进行预实验(在非实验课时间进行实验需提前向实验室管理老师进行预约)。实验中做好各项实验的原始记录，整理好实验结果并将预实验结果向指导老师进行汇报，如有需要更改、重做和补充的地方，在正式实验时加以更正。如指导老师认为预实验结果已达到要求，则实验即告完成，不必再进行正式实验，可以进行数据整理、论文写作和PowerPoint幻灯制作。

八、正式试验

如预实验的结果不理想，则实验需重做，或补充不理想的数据。

九、写论文及制作幻灯

将实验所得的数据进行整理分析，用Word按表5- 9- 1的格式书写论文(参照“复旦学报-医学版”的格式)，并制作PowerPoint幻灯(论文汇报时用)。在论文答辩前上交论文和幻灯的电子版(评分时用并存档)。

十、汇报、答辩

由实验小组选派代表，在规定的时间内(一般为10 min左右)向老师和全班同学汇报实验工作(论文)，汇报后老师和全班同学提问，全组同学进行答辩。

汇报内容(即制作PowerPoint的内容，利用论文的内容制作)包括:①题目，作者(小组成员)，指导老师;②立题依据:题目的研究目的、意义，以及所要解决的问题，国内外大致研究现状;③材料与方法:对材料作简略介绍，对引用、改良或创新的方法及其依据作简要说明;④结果:对实验所获得的结果，用图、表、照片、文字等数据作客观的展示，并可作必要的说明(不作讨论) ;⑤讨论:对实验所选用的研究项目和观察指标的目的、意义及其依据进行阐释，对实验结果的可靠性、正确性，以及是否达到了实验设计所预想的目标进行讨论，对方案设计和实验实施过程中存在的问题作必要的说明，并对本课题的进一步改进或深入提出设想和展望;⑥结论:对实验是否达到目的进行总结;⑦参考文献;⑧致谢:对完成实验给予帮助的老师和同学表示感谢。

表5- 9- 1　论文书写格式

十一、评分

评分由老师评、学生小组互评和小组内评3部分组成，依据是根据每组每个学生在整个过程中的具体表现(参与程度、动手能力、论文质量及汇报答辩表现等情况)，各部分成绩折成总分汇入总成绩。

评分依据和细则如下。

1．小组内评

( 1)在自行设计实验中所完成工作量大小，满分25分，工作量明显不足者≤12．5，不参加者0分。

( 2)论文的第一作者*加5分。

( 3)论文汇报者加5分。

2．小组互评综合评分(根据论文质量、汇报及答辩表现等)，满分25分。

3．教师评

( 1)实验论文的科学性、创新性，结果的真实性、准确性和讨论的条理性、明晰性，满分20分。

( 2)论文汇报和答辩表现，论文书写和幻灯表达的条理性和明晰性，满分20分。

( 3)创新附加分:对完全创新的实验最高加5分。

( 4)难度附加分:对难度相对较高的实验且成功完成的最高加5分。

( 5)答辩提问附加分:对能提出较高水平问题的个人最高加5分。

*论文作者:论文作者名次的排序依据是在整个实验中起主导作用者或实验方案主要设计者的排序，并非书写论文者为第一作者。

(杨轶群)