生物源拮抗物质提取与应用：SephadexG-100层析结果

试验结果如图5-1所示。拮抗菌B-FS01菌体的发酵液、无菌滤液、抗菌蛋白粗提液都有拮抗活性，而只有去蛋白上清液没有活性。这说明拮抗活性物质已被（NH4）2SO4沉淀下来，并逐级推断说明：滤液中的蛋白在起拮抗作用。

图5-1拮抗物提取过程中各溶液的拮抗活性
A—菌体发酵液；B—无菌滤液；C—滤液中蛋白粗提液；D—去蛋白上清液

最佳（NH4）2SO4饱和度的确定如图5-2所示。不同饱和度的拮抗蛋白均有抑菌活性，30％饱和度拮抗蛋白抑菌活性最低，70％饱和度拮抗蛋白抑菌活性最高，以后活性逐渐下降。由此可以确定提取拮抗蛋白最佳硫酸铵的饱和度为70％。

图5-2　（NH4）2SO4饱和度对提取拮抗蛋白及活性的影响

用70％饱和度的拮抗蛋白提取液和牛血清蛋白，分别点样电泳。经凝胶成像系统观察检测，结果如图5-3所示：拮抗蛋白粗提液有多条电泳条带，表明其由多个蛋白成分组成。牛血清蛋白表现出一个条带。

图5-370％饱和度的拮抗蛋白PAGE电泳
A—70％饱和度的拮抗蛋白；B—牛血清蛋白

如图5-4所示，把70％饱和度提取的拮抗蛋白粗提液和牛血清蛋白分别涂在相同条件的FPLC Superose-12 HR10/30柱上，得到各自的吸收峰。经比较发现，牛血清蛋白（Ⅰ）的吸收峰在洗脱体积为12.976mL时出现，拮抗蛋白粗提液（Ⅱ）的吸收峰在洗脱体积为18.618mL时出现。这说明拮抗蛋白的分子量比牛血清蛋白小。

图5-4　70％饱和度的拮抗蛋白经FPLC Superose-12 HR10/30柱的色谱
Ⅰ—牛血清蛋白；Ⅱ—B-FS01的拮抗蛋白粗提液

用紫外分光光度计测量洗脱液的光吸收值，用石英比色皿，在280nm处比色，以磷酸缓冲液（0.02mol/L，pH值为8.0）为空白对照。调零，按编号的刻度试管分别测定经过DEAE5 2纤维素柱洗脱的各管洗脱液的光吸收值，记录为A280。以A280为纵坐标，以洗脱液管号为横坐标，绘制洗脱曲线（如图5-5所示）。

图5-5　抗菌活性物质DEAE52纤维素柱层析

菌株B-FS01的70％饱和度硫酸铵盐析提取的拮抗蛋白，经过DEAE52纤维素柱洗脱后，出现2个洗脱峰。通过以烟草赤星病菌为指示菌，用对峙打孔法测活力，发现峰I活性最高。

洗脱结果如图5-6所示。

图5-6　抗菌活性物质Sephadex G-100柱层析

从图5-6可以看出：DEAE52纤维素柱层析后的活性峰Ⅰ组分，再经过SepHadexG-100凝胶层析，分离得到3个活性峰。其中，有一个较大的活性峰Ⅱ。以烟草赤星病菌为指示菌进行检测，峰Ⅱ有很强的抑菌活性，而峰Ⅰ活性很弱。以峰Ⅱ活性最大与最小一半处为上下限，合并收集峰Ⅱ，浓缩后透析，在冰箱4℃内保存，以备进一步电泳检测用。

把SepHadexG-100凝胶层析后的活性组分和标准蛋白质（中等分子量14.4～97.4kD）放入一倍体积的样品缓冲液并在沸水中加热3min，用微量进样器加样20uL，电泳结束后，经凝胶成像系统观察检测，结果如图5-7所示：Sephadex G-100柱层析后的峰Ⅱ浓缩透析后经SDS-PAGE分析，在标准分子量14.4～43.0，在38.0kD位置上有一个蛋白条带特别明显，比牛血清蛋白（66.2kDa）分子量小，这与FPLC分析结果相吻合，所以表明该蛋白已基本纯化。(www.xing528.com)

图5-7　拮抗蛋白粗提液SDS-PAGE凝胶电泳
M—标准蛋白质；1—拮抗蛋白粗提液

由电泳图谱可以看出，经过DEAE52纤维素柱层析和SepHadexG-100凝胶层析后，拮抗蛋白已基本得到纯化。

以烟草赤星病菌为指示菌，用对峙打孔法测定活性。结果如图5-8所示。

图5-8　温度对拮抗蛋白活性的影响

由图5-8可知，纯化的拮抗蛋白即使经过120℃处理30min，活性也只下降了16％（假设30℃时的活性为100％）。可见，此抗真菌蛋白有很好的热稳定性。

以烟草赤星病菌为指示菌，用对峙打孔法测定活性。结果如图5-9所示。

图5-9　pH值对拮抗蛋白活性的影响

由图5-9可知，纯化的拮抗蛋白在不同的pH值条件下，均具有活性，在pH值为6～7时活性最大。随着pH值减小，拮抗活性下降，并且在碱性条件下活性下降趋势缓慢。乳酸或NaOH溶液对照未表现出抑菌现象。由此可见，拮抗蛋白对酸的敏感性要强于碱。

经活性检测，纯化的拮抗蛋白对胃蛋白酶不敏感，对蛋白酶K部分敏感，而蛋白酶K和胃蛋白酶对照未表现出拮抗活性。

结果如图5-10所示。拮抗蛋白显著抑制孢子萌发。

图5-10　纯化的拮抗蛋白对小麦赤霉菌孢子萌发的抑制作用
A—处理；B—对照

结果如图5-11所示。结果处理中的小麦赤霉菌菌丝变形，生长缓慢，并且菌丝溢缩，逐渐溶解。

图5-11　纯化的拮抗蛋白对小麦赤霉菌菌丝生长的抑制作用
A—对照；B—处理