生物源拮抗物质提取和应用：材料与方法

拮抗菌B-FS01和番茄灰霉病菌（B．cinerea）均为本室分离。

被用于叶片和番茄果定殖研究的番茄苗为番茄品种L—402。温室育苗，盆杯移栽。

（1）利福平母液的配制

1×103μg/mL：将1×150mg利福平（Rifampicin）加入150mL无菌水中，摇匀。

5×102μg/mL：将1×150mg利福平（Rifampicin）加入300mL无菌水中，摇匀。

1×102μg/mL：将10mL 1×103μg/mL利福平（Rifampicin）母液加入90mL无菌水中，摇匀。

1×10μg/mL：将1mL 1×102μg/mL利福平（Rifampicin）母液加入9mL无菌水中，摇匀。

以上配制的4种不同浓度的母液，于冰箱中保藏，保存期为7d。

（2）拮抗细菌对利福平敏感浓度的测定

制备含（0～1）μg/mL，（0～2）μg/mL Rf的非梯度NA平板。配方如表4-1所示。使Rf药液与融化的NA充分混匀，凝固。这些平板，在使用前24h制备^[68]。待培养基表面冷凝水被去除后，吸取试验细菌菌株的悬浮液0.2mL于非梯度平板中，用涂布器涂抹均匀，在30℃下恒温培养3d后，观察细菌大致的敏感浓度范围。

表4-1　含Rf的NA非梯度平板配法

（3）耐利福平标记菌株的诱导

采用含Rf肉汤梯度培养法^[69]。菌株在低于其敏感浓度的利福平肉汁胨培养液中开始培养，后采用逐级提高药物浓度的方法诱导培养，使细菌不断提高耐药性。细菌在每一药物浓度中适应3代，继续诱导至能耐受Rf 350μg/mL时，分别经不含药肉汤和不含药NA平板交替继续培养4代，再回接含Rf 350μg/mL的培养基平板，以证实耐药性；已遗传稳定后，转接试管，冰箱保存。

逐级诱导的药物浓度分别为0.5，1，2，4，8，16，32，64，128，256，350μg/mL。配方如表4-2表示。

表4-2　逐级诱导的药物浓度配制方法

（4）耐药标记菌株与原始菌株拮抗能力的比较

测定拮抗细菌原始菌株与耐利福平菌株对灰霉病菌的拮抗能力。参照“第3章材料与方法中的拮抗谱的测定”。

（1）耐药标记细菌悬浮液的制备

将冰箱保存的耐利福平细菌菌株移植到装有液体培养基的三角瓶中，在30℃下培养48h，然后用移液管吸取1mL置于装有200mL肉汁胨培养液的三角瓶中，振荡培养（120r/min）72h。在使用细菌悬浮液之前用平板稀释法测定其浓度。(www.xing528.com)

（2）磷酸缓冲液PBS的配制

0.2MNa2HPO4·12H2O溶液A：每升无菌水中加入Na2HPO4·12H2O71.46g。

0.2MNaH2PO4·2H2O溶液B：每升无菌水中加入NaH2PO4·2H2O31.21g。

将上述两种盐溶液分瓶装好，用时取A溶液61mL，B溶液39mL，混合即得pH7.0，0.2M的PBS。

（3）拮抗细菌在番茄叶表的定殖试验

培育番茄苗至10cm高时，将其移栽到小盆杯中，每盆一株。待长至20～30cm高时，开始用于试验。试验时将下部的老黄叶摘除。罩膜保湿（RH 95％～100％），光照12h，温度为25℃～33℃。每细菌菌株用苗15盆，用毛笔蘸取抗Rf 350μg/mL的标记菌株悬浮液在叶片正面来回涂抹两次接种。设不接菌为对照。引进拮抗细菌后0，1，3，6，10，15d，分别用稀释平板法测定细菌在番茄叶表的定殖数量（每平方厘米叶片上拮抗细菌数量）。

试验中用于测定拮抗细菌数量的平板中含利福平300μg/mL。能基本抑制环境中其他杂菌的生长。每次处理时随机取叶组织12～48cm2（每叶视大小取1～3cm2）。将叶组织放在研钵内，加入5mL PBS进行研磨。研成浆状物后，将其转入含有55mL无菌水的三角瓶中，用40mL无菌水分几次冲洗研钵，并将洗液也置入三角瓶。这样得到100mL总量的悬浮液。然后取1mL悬浮液置于9mL肉汁胨培养液中，进行逐级梯度稀释。取0.2mL不同梯度的稀释液，将其涂布在含有300μg/mL利福平的平板上，在28℃～30℃下培养72h后，记载菌落数，换算成浓度（cfu/cm2）及浓度对数（lg cfu/cm2）。

（4）拮抗细菌在番茄果表的定殖试验

①无机盐营养液制备

在1000mL无菌水中加入4.284g（NH4）2SO4，3.730g（NH4）H2PO4，1.439g K3PO4·3H2O，0.547g KNO3，上述无机盐混合物总量为10g，浓度为1％，N∶P∶K为19∶7∶4。用作番茄果的保鲜。

②灰葡萄孢菌丝悬浮液制备

将灰霉病菌接种到PSA平板上，待长满平皿（φ9cm）后，取2皿菌落（含培养基）加水200mL，以组织捣碎机（8000r/min）捣碎2min。

③定殖试验方法

采摘未红的番茄青果，保留果柄，将其置于24孔塑料板的孔上。板由6只（3×2排列）培养皿底支撑，皿内放满无机盐营养液，将果柄浸入营养液中。每塑料板上放6～10只青果，果实大小基本一致。设不接细菌为对照。采用浸果法接种抗350μg/mL Rf的细菌菌株。引进拮抗菌后0，1，3，6，10，15d分别用稀释平板法测定拮抗菌在番茄果实上的定殖数量（每平方厘米果皮上拮抗细菌数量）。

试验中被用于测定拮抗细菌数量的平板中含300μg/mL利福平。每次处理时随机用打孔器（φ6mm）取样15～25个果皮层块。将这些果皮块放在研钵内，加入5mL PBS后进行研磨；研成浆状物后，将其移入含55mL无菌水的三角瓶中；用40mL无菌水分几次冲洗研钵，并将洗液也置入三角瓶。这样得到100mL总量的悬浮液。然后，用9mL的NB液体培养基进行梯度稀释。取0.2mL不同梯度的稀释液，将其涂布在含有300μg/mL利福平的平板上，在30℃下培养72h，记载拮抗菌菌落数，换算成浓度（cfu/cm2）及浓度对数（lg cfu/cm2）。

每株拮抗细菌设3种不同浓度（109，107和105cfu/mL），进行浸果接种。设不接细菌为对照。试验中保持恒定的湿度（RH 95％～100％）、光照（12h）和温度（25℃～33℃）。

（5）不同时间接种灰霉对拮抗细菌定殖的影响

拮抗细菌接种采用细菌悬浮液喷雾方法。灰霉菌接种采用菌丝悬浮液浸果方法。设拮抗细菌接种前一天接灰霉，拮抗细菌与灰霉同时接种。拮抗细菌接种后一天接灰霉3个处理。试验中保持恒定的湿度（RH 95％～100％）、光照（12h）和温度（25℃～33℃），记载拮抗菌菌落数。