拮抗细菌活性物质及应用：研究概况

拮抗微生物在代谢活动中通过分泌抗菌物质直接对病原物产生抑制是自然界中普遍存在的现象，也是众多拮抗微生物应用的物质基础。作为微生物代谢产物的抗生素，对于抑制病原菌的侵染和病害的发展有着重要作用。传统的方法是用对峙培养法测定抑菌圈，以确定该菌在生物防治中有无抗生素的涉及，但这种方法并不能直接证实在实际的生态环境中抗生素依然产生并起到抑制病原的作用。最近，液相色谱分析证实了荧光假单胞菌在土壤中仍然可以产生抗生素。进一步运用遗传工程技术使荧光假单胞菌丧失抗生素的产生能力并伴之失去防病能力，经修复还原抗生素代谢能力后，生物防治活性也恢复到野生菌株的水平，从而证明了抗生素在生防中的重要作用^[29]。

拮抗微生物产生的抗菌物质主要有两类：一类是小分子的抗生素；另一类是大分子的抗菌蛋白或细胞壁降解酶类。

（1）抗生素类

芽孢杆菌抗生素是其表现抗菌作用的重要物质基础之一。芽孢杆菌的抗生素有核糖体和非核糖体合成2类。非核糖体合成的抗生素包括脂肽抗生素（lipopeptide）、多肽抗生素和次生代谢产生的抗菌活性物质。

①脂肽抗生素

Iturin家族脂肽抗生素，一般对真菌具有强烈拮抗作用。目前报道的有B．subtilis合成的Iturin A，C，以及Bacillomycin L，D，F和Mycosubtilin等^[15]，^[30]，^[31]。

②多肽抗生素

芽孢杆菌多肽抗生素有线状、环状和分支环状3类。Gramicidin和Edeine是B．brevis产生的线状抗真菌短肽^[13]。Gramicidin S和Tyrocidine是B．brevis产生的环状短肽抗生素^[30]-^[32]。分支的环肽抗生素包括Polymyxin，Octapeptins，以及Bacitracin。它们主要作用于细菌。近年来多肽类抗生素的研究日益受到重视。研究的进一步发展可通过基因定点突变技术对其分子结构进行修饰，以提高其活性。如Chen等（Chen H C，Brown J H，Morell J L，1998）采用该技术修饰抗菌肽Magainin 2，使其活性提高了100倍，与其他抗生素化学或半合成修饰相比，既方便，又省成本^[33]。

③其他抗生素

Zwittermicin A是线状聚酰胺物，在B．cereus和B．thuringiensis的很多菌株中都存在^[31]。Zwittermicin A对原核生物和真菌具有广谱抑菌活性，对Phytophthora和Pythium属病原真菌活性极强，并对Bt杀虫晶体蛋白具有协同增效作用。

（2）核糖体合成的抗菌蛋白

芽孢杆菌分泌产生的蛋白类抗菌物质主要有细菌素、细胞壁降解酶（如几丁质酶和葡聚糖酶）以及一些未鉴定的抗菌蛋白。

①细菌素

细菌素是细菌合成的对其他微生物具有抗生作用的小分子量蛋白质。芽孢杆菌能产生多种细菌素^[32]，^[35]。枯草芽孢杆菌产生的Subtilis和Subtilisin及巨大芽孢杆菌产生的Megacins对G＋细菌具有很强的活性。枯草芽孢杆菌产生的Botrycidin AJ1316，Alirin B-1，6.9kDa小肽，以及Bacillus licheniformis M-4产生的M-4 Amoebicidal同时具有抗细菌和真菌作用。

②几丁质酶和葡聚糖酶(www.xing528.com)

许多病原真菌细胞壁含有几丁质和β-l，3-葡聚糖。几丁质酶（chitinase）和β-l，3-葡聚糖酶（glucanase）是植物病程相关蛋白。它们通过破坏病原真菌的细胞壁而具有抗菌防病作用。最早报道几丁质酶活性的微生物是芽孢杆菌B．chitinovrous，目前涉及B．subtilis，B．coagulans，B．megaterium，B．licheniformis，B．thuringiensis，B．cereus，B．circulans，B．stearothermophilus，以及B．pabuli等很多芽孢杆菌种群^[36]，^[37]。

③其他抗菌蛋白

TasA（transition-phase sporeassociated antibacterial-protein）抗菌蛋白是Axel从枯草芽孢杆菌PY79菌株分离的孢子成分，对G＋和G-细菌具有广谱抗菌活性^[35]。基因tasA是通过氨基酸序列测定和枯草芽孢杆菌基因组序列文库比较获得的。TasA前体为34kD孢子内蛋白，经信号肽酶SipW加工除去N端27个氨基酸成为31kD活性蛋白形式，并进一步掺入孢子外衣，但对孢子形成无明显作用。近年来我国有很多分离纯化枯草芽孢杆菌未知抗菌蛋白的报道，如B034菌株50.3kDa和A014菌株22.5kDa抗水稻白叶枯病蛋白，以及BS-98菌株59kDa，TG26菌株14kDa，B3菌株13kDa和BS-908抗真菌蛋白质等，但还未见到有关基因研究的报道^[16]。

芽孢杆菌类生防细菌大多是通过产生抗菌蛋白或裂解酶抑制病菌的侵染。如抗稻白叶枯病的芽孢杆菌A014，枯草芽孢杆菌B034，A30，XML6，B0113，BS—98，TG26，B—916，B3，青枯生防菌芽孢杆菌B130，芽孢杆菌属的XA1，XF1等菌株^[36]均能产生抗菌蛋白或多肽。B．brevis可分泌抗黄瓜白粉病菌的短杆菌肽（gramicidin）。解淀粉芽孢杆菌（B．amyloliquefaciens）产生一种抗真菌环状多肽，即Iturin A2。徐敬友等（2002）发现，抗灰霉等多种病原真菌的地衣芽孢杆菌和多粘类芽孢杆菌培养液中具有拮抗活性的物质是一种蛋白或多肽。Wakayama（Wakayama S，Lshikawa F Osihik，1984）从蜡状芽孢杆菌（B．cereus）中纯化出一种抗真菌环状多肽Mycocerin。其抑菌谱广、活力强，能同时对丝状真菌和酵母起作用，且耐热性和稳定性好。裴炎等（1999，2002）的最新报道称，从蜡状芽孢杆菌S-1菌株中分离出抗真菌多肽APS-1环状多肽，浓度为2μg/mL即可抑制黑曲霉和瓜果腐霉，并且已经分离、纯化出该物质。另一经常报道的抗菌细菌为枯草芽孢杆菌（B．subtilis）。如刘颖等（1999）从枯草芽孢杆菌中分离出的抗真菌肽LP-1，为一种广谱抗真菌小肽，对瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）、玉蜀黍赤霉病菌（Gibberella zeae）、长柄链格孢（Alternaria longipes）和水稻稻梨孢（Pyriculoria oryzae）等有很强的抑制作用^[40]。孔建等（1999）报道，枯草芽孢杆菌B-903产生一种耐高温抗菌物质，有广泛的抑菌谱，包括土传镰刀菌（Fusarium axysporium）、气传植物病原菌（如苹果轮纹病）（Physalospora piricola）、番茄早疫病（Alternaria solani）和韧皮部病菌^[41]。近来，国内外学者还利用体外合成的多肽物质对病原微生物进行拮抗试验，也收到了很好的效果。如Kanniah Rajasekaran等在体外合成的多肽D4E1对子囊菌类、担子菌类、半知菌类、卵菌类以及细菌都有很好的抑制效果（Kanniah Rajasekaran，2001）。Gul Shad Ali and A．S．N．Reday也发现，一种环肽能广泛抑制植物病原真菌和细菌（Gul Ahad Ali and A．S．N．Reddy，2000）。Belen Lopez-Garcia等对引起水果腐烂的植物病原真菌起抑制作用的六肽进行了鉴定和特性分析（Belen Lopez-Garcia，2000）。中科院上海生物工程研究中心的陆莹瑾等固相合成了4种抗菌肽，对多种植物和动物病原细菌均具有抗性^[42]-^[45]。

（1）抗生作用

由于细菌的同化作用而产生的抗菌物质对病原菌生长繁殖的抑制作用被称为抗生作用或拮抗作用。这些抗生物质在很低浓度下即可对病原菌等其他微生物的生长和代谢活动产生毒害作用。这类抗生物质大致包括抗生素、细菌素（bacteriocin）、蛋白质类抗真菌素及挥发性抑菌物质等。

①芽孢杆菌抗生素

生防芽孢杆菌往往同时产生多种对特定病原菌具有很高活性的抗生素。无细胞培养物或抗生素粗提物平板抑菌试验和田间防病试验均能直接反映抗生素的生防作用。如B916无细胞培养液对水稻纹枯病防效可达58.1％，而孢子发酵液的为77％^[17]。B．subtilis M51脂肽抗生素Iturin A2使用浓度为100μg/g的土时就能完全抑制Fusarium oxysporum f．sp．lycopersici对番茄的侵染^[13]。目前，生防芽孢杆菌发酵液、无细胞培养液、抗生素和产抗生素缺失突变株的综合防病试验，已经系统证明抗生素是芽孢杆菌抗菌防病作用的重要机制。已证实B．subtilis CL27能产生3种抗生素。其中，一种为非多肽抗生素，只对Botrytis cinerea有活性；另两种为多肽抗生素：一种对Alternaria brassicicola有高活性，而另一种同时对两种病原菌有活性。

Utkhede和Rahe（1980）发现，B．subtilis能产生抑制S．cepivoum的抗生素。Broadbent等（1971）对A1 3菌株在离体条件下的广谱抗生作用研究后认为，该菌是通过对聚居于植株根部的有害微生物或对其毒素的抑制作用促进植株生长的；Cubeta等（1985）对Bsl菌株的抗生试验研究后发现，该菌株能对包括青霉菌（Penicillium sp）在内的26种大豆种子病菌起杀菌或抑菌作用，即使经高压灭菌后的培养物滤液，仍能抑制病菌Phomopsis sp的生长和子座的形成；Dunleavy（1955）和Mckeen等（1986），Baker等（1983），Pusey和Wilson（1984）分别用B．subtilis的不同分离物进行的各类病害防治试验一致表明，产生抗生素是该菌的共同防病机理。业已发现B．subtilis类抗生体可产生诸如枯草菌素（subtilis）、杆菌毒霉素（toximycin）、伊枯草菌素A（iturinA）、抗霉枯草菌素（mycosubtilin）、酶基肽（acylpeptide）、优霉素（eumycin）、伊枯草菌素C及枯草杆菌肽（bacitracin）等多肽类抗生素，多肽抗生素26a，以及杆菌毒素S．L．D（bacillomycin S．L．D）等蛋白类抗真菌素，有的甚至还能产生挥发性的抑菌物质。这些抗菌物质或抑制菌丝生长，或抑制孢子萌发，或二者兼具，对病菌产生有效的拮抗作用。例如B．subtilis NCIB8872及PRS^[46]等菌株产生的挥发性代谢物质几乎可完全抑制Penicillium spp．Aspergillus ochracens及R．solani等病菌菌丝的生长和孢子及毒素的形成，阻止病害的发生。生产实践中，主要是通过改变土壤或特定空间（如包装容器）的气体组成抑制病菌生长的。在已知的50多种抗生素中，绝大多数都是不常见的氨基酸、多肽或含氮（N）杂环化合物等次生代谢产物。

Pseudomonas产生的抗生物质包括细菌素、抗生素等，种类很多，如Pyoluteorin，Pyrrolnitrin（Chao W．L Nelson E B，Harman G E，Hoch H C，1986），能有机地抑制菌丝生长和孢子萌发，降低菌核的活性等，从而达到防病效果^[47]。

②抗菌蛋白的生防作用

微生物抗菌蛋白的生防作用不仅被平板抑菌试验证实，而且已经被应用于植病生防试验和生产实践^[16]，^[37]。Enterobacter agglomerans对R．solani引起的棉花病害防效为64％～86％，而其产的几丁质酶突变株则没有抗菌作用。Aeromonas caviae几丁质酶能使R．solani，F．oxysporum，以及Sclerotium rolfsii引起的棉花和菜豆病害减轻78％、57％和60％。Serratia marcescens几丁质酶基因chiA导入荧光假单胞菌、大肠杆菌和高等植物已经获得有显著防效的转基因遗传工程体，但对于芽孢杆菌几丁质酶、葡聚糖酶和其他抗菌蛋白的植病生防作用目前只涉及平板抑菌活性研究，尚未见到有关直接的遗传证据和防治应用报道。

（2）溶菌作用

许多B．subtilis类拮抗体产生的次生性代谢物质对病原菌的菌丝或孢子的细胞壁产生溶解作用，致病菌细胞壁穿孔、畸形、菌丝断裂、原生质消解、外溢而丧失活力。例如，B．subtilis PRS5菌株的代谢产物可使R．solani菌丝分隔增多，隔间变短，胞内原生质消解，胞壁大量穿孔，或不规则消解，菌丝缩短、断裂，原生质外溢解体而失活。Rovira A．D．和Campbell R．通过电镜扫描发现，P．fluorescens定殖在Gaeumonnomyces graminis菌丝上对菌丝产生溶解作用。胡炳福观察到，Pseudomonas spp．对Hypoderma desmazierii，Fusarium sp．Lophodermium pinastri，L．unicinatum的孢子有明显的溶解作用。