痴呆的分子生物学基因检查：新发现！

近年来，随着分子生物学技术的发展，人们对痴呆特别是阿尔茨海默病的分子机制研究逐渐深入，找到了若干与其发病密切相关的基因。本章主要介绍阿尔茨海默病（AD）和亨廷顿病（HD）的分子生物学机制、相关基因及基因检测的主要分子生物学方法。

一、基因检查的常用分子生物学方法

随着近年来分子生物学的飞速发展及人类基因组计划的完成，大量蛋白质的编码基因得到克隆定位。在痴呆的发病机制研究中，人们发现很多蛋白可能参与了发病，如与AD发病有关的蛋白：载脂蛋白E（ApoE）、β淀粉样前体蛋白（APP）、早老素蛋白（PSI）等。当上述蛋白的编码基因是某种特定的基因型或发生变异时，携带该基因的个体发生AD的可能性将大大增加。对某些高危人群进行相关基因的检查，将对诊断预防某些疾病有所帮助。如对有家族史的个体进行AD相关基因（APP、PS等编码基因）的检查，可帮助诊断该病，并提早预防。本章仅讨论已知可能致病基因的检查方法。

1．聚合酶链式反应（PCR）对某一DNA片段的序列进行分析需要较高浓度及纯度的该片段，而直接从人体组织提取的DNA并不能满足这一要求。近年来出现的PCR技术解决了这一难题。PCR技术是一种在生物体外特异性扩增DNA片段的技术，该技术满足了对某一DNA片段序列进行分析需要的较高浓度及纯度。本法操作简便，可在数小时内大量扩增某一特异DNA序列。

PCR技术实际上是在体外人工模拟了生物体内的DNA扩增过程。耐热DNA聚合酶的发现使得这一技术成为可能。以需要扩增的DNA片段为模板，加入一对特异性引物及4种脱氧核糖核酸（即DNA序列中的各碱基A、T、C、G）、Mg2＋等，以耐热DNA聚合酶催化完成该反应。PCR反应的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性，引物的设计对反应的顺利完成至关重要。

2．限制性内切酶的应用 得到PCR产物后，就要对其进行分析。如要检测某DNA片段的已知多态性位点及基因型，限制性内切酶法通常是最为便捷的方法之一。分子生物学实验中用到的一般是E型限制性内切酶，它可以识别特异的双链DNA序列，并在这一特异性序列内进行切割，产生特异性片段。以下举例简要说明酶切法的应用：HhaⅠ酶，它可以特异性识别双链DNA序列中的－GCGC－片段，并在第3个碱基G后切割DNA序列，产生特异性片段。当用PCR法扩增出了所需DNA片段后，想要进一步知道这两个多态位点的等位基因型，可用HhaⅠ酶对这一PCR产物进行酶切，当第1个位点是T时，不能被该酶识别，则不能在该位点酶切，反之则可被该酶识别，从而在该位点切断双链DNA，形成两个较短的DNA片段。第2个多态性位点同理可被切开再断裂成更短的片段或不被切开保持原状。酶切完以后的产物经过聚丙烯凝胶电泳可以将酶切片段区分，经过对电泳结果的判断，可以得出上述两个等位基因的基因型。

酶切法成本低，操作简单，是最为常用的分子生物学方法，详细原理及操作方法请参看有关实验手册。

3．酶链式反应－单链构象多态性（PCR－SSCP）当我们想知道一段DNA片段中是否存在突变，酶切法已无能为力了，因为我们并不能预先知道突变位点在哪里。这时PCR－SSCP可以较好地发挥作用。PCR－SSCP在大样本检查基因突变时可以作为候选方法之一，它具有灵敏度高、成本低等优点，但缺点也很明显，如操作烦琐，最终结果还需要其他方法验证，易出现假阳性等。

4．变性高效液相色谱法（DHPLC）DHPLC也是大样本筛查DNA突变的候选方法之一。该法实现了自动化，方便快捷，但同样有假阳性、最终突变位点需测序法验证等缺点。

5．直接测序法 在DNA序列分析的方法中，被大家公认的金标准是直接测序法，其结果可靠，直观，方便快捷。以目前的技术，对一段700bp左右的DNA片段进行双向测序，其结果的准确率几乎可达100%。仅几年前，DNA测序的费用还相当昂贵，一个测序反应可达上百元人民币，限制了DNA测序的广泛应用。近来，随着费用的大幅下降，测序法在大样本DNA突变及多态性的筛查中得到广泛应用。

二、阿尔茨海默病和亨廷顿病的分子生物学机制及相关基因

（一）阿尔茨海默病

阿尔茨海默病（AD）的主要病理特征包括神经炎性斑、神经原纤维缠结（NFTs）、颗粒空泡变性和淀粉性血管病。上述病理改变是如何产生的一直是人们研究的热点，多年来，经过广大学者的不懈努力，AD的分子生物学机制已经取得了一些进展，现简述如下。

1．β－淀粉样蛋白的生成及淀粉样蛋白前体蛋白基因 目前已经阎明，β－淀粉样蛋白（Aβ）是神经炎性斑的主要成分，它是由39～43个氨基酸组成的多肽。人体内Aβ由β淀粉样前体蛋白（APP）水解产生。APP在内质网内产生，经过高尔基体一系列的加工修饰后，成为一种具有多个功能区及一个跨膜域的糖蛋白，主要由膜外N末端片段、跨膜区和膜内C末端片段3部分构成。其编码基因位于21q11．2～22．2，长约190kb，共19个外显子：外显子1～13，13a，14～18。通过不同的外显子剪切方式，可产生多种APP亚型。人体中主要的3个转录产物是：APP695、APP751、APP770。在神经元内，主要表达产物是APP695。在APP蛋白序列中，组成Aβ的39～43个氨基酸由外显子16及17编码，这两个外显子的突变是家族性阿尔茨海默病（FAD）的致病原因之一。

APP具有两种分泌酶水解途径：在细胞外完成的α分泌酶途径和在细胞内完成的自分泌酶途径。后者生成Aβ并释放到胞外形成Aβ沉积。目前有一种观点认为，Aβ寡聚体具有更强的细胞毒性作用。体内试验表明，在没有Aβ单体存在的情况下，Aβ寡聚体可以破坏细胞突触可塑性。Aβ的长度对于决定其性质十分重要，长片段的Aβ42、Aβ43比Aβ40具有更强的纤维原性和聚集性，更容易形成Aβ沉积。Aβ可以诱导细胞凋亡和tau蛋白过度异常磷酸化，促进双股螺旋丝（PHF）和NFTs形成，最终导致神经元退行性变。

APP编码基因突变可导致早发性家族性AD，该病为常染色体显性遗传。最早发现的是在第717位密码子错义突变，导致正常编码的缬氨酸替换为异亮氨酸。此后，在FAD患者中又发现了多个APP编码基因的突变位点。由于这些突变位点大多位于APP水解位点附近，所以人们推测突变的APP蛋白可能影响了α、β、γ分泌酶的正常水解作用，导致Aβ生成增多，使得Aβ在细胞外大量沉积，从而发挥细胞毒性作用。

2．早老素－1（PS1）和早老素－2（PS2）基因 PS1蛋白最早在一个早发家族性AD家系（EOAD）中被发现，因而得名。PS1蛋白在AD的发病中发挥了重要作用。文献报道，超过60%的FAD是由于PS1基因突变所致。PS2同样最早发现于EOAD家系中，其氨基酸序列与PS1蛋白有着高度同源性（80．5%），但仅有不到10%的FAD可检测到PS2基因的突变。

（1）PS1蛋白及其编码基因：PS1基因位于14q24．3，共14个外显子，其中4～14为编码外显子。通过不同的外显子剪切方式，可产生几个PS1亚型，分别由374、463、467个氨基酸残基组成。PS1基因最早在一个FAD家系中被发现，其编码的PS1蛋白是一个由467个氨基酸组成的包含至少7个跨膜区的蛋白质，它的氨基端和羧基端都位于细胞内，中间部分在细胞膜两侧折叠形成跨膜区。全长的PS1蛋白分子量为47kD，在大脑和其他组织中均有表达，其主要位于胞内细胞器的膜上，包括核膜、内质网膜和高尔基体膜。人体中，多数的全长PS1水解为28kD的N末端和19kD的C末端，而在转染了某些突变型的PS1的细胞中，则只有全长的PS1，因此人们推测，突变的PS1影响了自身正常水解过程，无法发挥生理功能，导致AD的发病。(www.xing528.com)

（2）PS2蛋白及其编码基因：PS2基因位于1p31．42，共12个外显子，其中3～12为编码外显子。PS2基因最早在一个EOAD家系中被发现，其编码的是一个由448个氨基酸组成的具有7个跨膜区的蛋白质，PS2蛋白与PS1蛋白在结构上非常相似，它们有80．5%氨基酸序列是完全相同的，并且与PS1蛋白一样，PS2蛋白同样位于胞内细胞器的膜上，包括核膜、内质网膜和高尔基体膜。有研究表明，二者共同参与了体内的一些生理过程，如APP的水解。

（3）PS1和PS2在AD发病中的作用机制：PS1和PS2的确切生理功能目前尚不十分清楚，近年来的研究表明，二者突变后可能通过以下机制参与了AD的发病过程。

①突变的PS1和PS2影响了APP的正常水解：它们的作用机制还不清楚，但有一点是肯定的，PS1和PS2在APP水解生成Aβ的过程中发挥了重要作用，而二者突变后的致病作用之一是由于增加了Aβ，尤其是Aβ42的生成所导致的。病理性Aβ增多可通过以下机制发挥细胞毒性作用：增加了神经细胞对氧化应激的敏感性；破坏了细胞内外钙离子平衡，导致细胞内钙离子浓度升高，引起细胞死亡；作用于多个信号传导通路，诱导细胞过度凋亡。

②突变的PS1和PS2影响了Notch信号传导通路：在Notch信号传导通路中，Notch细胞内功能域（NICD）是一个十分重要的组成部分。有研究证实，在哺乳动物细胞中，NICD是在PS1和 PS2蛋白共同作用下，在Notch的某个跨膜域上水解产生的。与APP的γ分泌酶水解过程不同，PS1和PS2蛋白对Notch蛋白的水解是必不可少的正常生理过程，当二者发生突变时，可能会影响其水解Notch生成NICD的过程，从而阻碍了Notch信号通路的成熟，对中枢神经细胞产生影响。

③突变的PS1影响了β－连环素（β－catenin）的功能：β－catenin是一种连接蛋白，它能够调节胚胎发育、损伤修复、肿瘤细胞分化、上皮细胞的生长，β－catenin缺乏或功能缺失将会使神经元对Aβ诱导的细胞凋亡的敏感性增加。研究证实，正常的PS1蛋白可以与β－catenin形成复合物，从而增加β－catenin的稳定性，同时，PS1还不依赖于经典的Wnt通路而单独调节β－catenin的磷酸化。突变的PS1可能因为失去了稳定β－catenin的作用，从而使后者在体内水平降低，导致神经元的过度凋亡。

3．微管相关tau蛋白（MAPT）基因 tau蛋白基因位于17q21．1，长约100kb，共14个外显子，其中2～14外显子编码tau蛋白，通过不同的外显子剪切方式，可产生多种亚型。在成人大脑中有6种tau蛋白亚型表达，它们分别由352、381、383、410、412和441个氨基酸残基组成。目前已发现，tau蛋白的功能异常与包括AD在内的多个神经系统退行性疾病相关。

异常过度磷酸化的tau蛋白参与了AD的特征性病理变化——NFTs的形成。tau蛋白具有多个磷酸化位点，在某些病理条件下，tau蛋白会发生异常过度磷酸化，这时的tau蛋白可以相互结合形成双螺旋细丝（PHFs），从而失去结合微管蛋白的能力，导致微管形成障碍。PH只是NFTs的主要成分之一。并且，异常过度磷酸化的tau蛋白还可以与微管蛋白竞争结合正常的tau蛋白，使后者进一步减少，微管形成更加困难。神经元内微管数量减少，使得胞体与轴突不能进行正常的营养交换，导致轴突萎缩减少，最终神经元死亡。

除AD外，tau蛋白功能异常还与多种神经系统退行性疾病相关。目前已发现，tau蛋白编码基因突变可能是伴有帕金森症状的额颞叶痴呆、皮克病、帕金森病、进行性核上性麻痹等疾病的致病原因之一。

4．载脂蛋白E（ApoE）基因 ApoE基因位于19q13．2，长约3．7kb，共4个外显子。其中第4外显子上存在两个多态性位点，形成了ε2、ε3、ε4共3种等位基因，这3个基因型编码产生了3种ApoE亚型：ApoE2、ApoE3和ApoE4。大量研究证实，ε4等位基因与晚发性AD密切相关，随着ε4等位基因增加，AD发病的危险显著增加，发病年龄明显提前。

有研究表明，ApoE2、ApoE3能在胞质内与Aβ及tau蛋白结合，防止tau蛋白过度异常磷酸化，抑制NFTs及神经炎性斑的形成，对AD的发病有保护作用。ε4等位基因导致AD发病危险增加的机制目前尚不清楚，可能与脂质代谢有关。

5．与AD有关的其他基因 除APP、PSI、PS2、tau蛋白和ApoE的编码基因外，还有其他一些基因可能与AD的发病多种应有关，它们包括：α2－巨球蛋白、早老素增强因子、低密度脂蛋白受体相关蛋白基因、白介素－1基因、血管紧张素转化酶基因、极低密度脂蛋白受体基因、丁酰胆碱酯酶基因以及α1－抗糜蛋白酶基因等。

（二）亨廷顿病

亨廷顿病（HD）是一种常染色体显性遗传病，主要表现为进行性的舞蹈症状和痴呆。该病与位于染色体4p16．3的名为亨廷顿的基因变异有关。亨廷顿基因长约200kb，含67个外显子，编码亨廷顿蛋白。在该基因第一外显子上有一段连续的CAG重复序列，在正常人，这3个碱基的重复次数为6～35，而在HD患者中，CAG重复次数则≥36。根据全美遗传学会与全美人类遗传学协会亨廷顿病基因检测学组的研究结果，CAG重复次数≤26为正常基因；CAG重复次数在27～35时，携带者本人不发病，但其后代容易发生扩展突变而发病；CAG重复次数在36～39时，为致病基因，但并不完全外显，携带者可为正常表型，也可发病。CAG重复次数≥40时，为100%外显的致病基因，携带者肯定发病。HD的遗传具有不稳定性，从亲代向子代遗传时，CAG片段的重复次数多有增加，这有可能导致子代的发病年龄较亲代提前。父系遗传时CAG片段重复次数增多较母系遗传时更为明显，所以父系遗传时子代发病年龄更早。

亨廷顿蛋白在大脑皮质、胶状体和周围组织中有广泛表达，其确切生理功能尚不清楚，但有研究表明，亨廷顿蛋白可能参与了人体生长发育、细胞内突触营养交换和细胞间的物质转运。CAG重复片段编码的是一个多聚谷氨酰胺序列，亨廷顿蛋白中的谷氨酰胺残基异常增加可能影响了自身功能，从而导致了HD的发病。实验证明，变异的亨廷顿蛋白可以抵抗蛋白酶的水解，在细胞内大量聚集，这种聚集可以发挥细胞毒性作用，诱导细胞凋亡，最后导致神经细胞的死亡。

其他类型的痴呆，如额颞叶痴呆、进行性核上性麻痹、路易体痴呆等分子生物学机制，请参看各分论。

（邢邯英　靳　玮　暴云锋）