植物组织培养中的玻璃化问题

三、组培苗的玻璃化问题

植物组织培养时，经常会发现试管苗生长异常，其形态特征表现为组培苗的叶、嫩梢呈水晶透明或半透的水浸状；整株矮小肿胀、失绿；叶片皱缩成纵向卷曲、脆弱易碎。其解剖特征表现为细胞间隙大；导管和管胞木质化不完全；叶表缺少角质层蜡质；没有功能性气孔，气孔器的保卫细胞畸形，甚至堵塞孔道，不正常气孔器的比例达90%，认为保卫细胞畸形是导致气孔功能异常的主要原因；不具有栅栏组织，仅有海绵组织；叶表有大量的排水孔。玻璃苗的生理功能也因其体内含水量高，干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和木质素含量低，角质层、栅栏组织等发育不全，导致光合能力和酶活性降低，分化能力降低，所以难以继续用作继代培养和扩大繁殖的材料；生根困难，移栽后也很难成活。Debergh等将试管苗这种生长异常现象称为“玻璃化”（vitrification），也称过度水化现象。这是植物组织培养过程中所特有的一种生理失调或生理病变，在自然环境中的陆生植物未见有这种现象发生。植物玻璃化在组织培养中普遍存在，在草本与木本植物中均有发生，已报道出现玻璃化苗的植物已达70多种。

（一）玻璃苗的成因

玻璃化现象是植物组织培养中特有的现象。培养基成分和培养条件等各种内外因素都影响玻璃苗的发生，其中研究较多的是培养基水势、细胞分裂素、氮源和碳源的状况。

1．材料差异

众多研究表明，培养材料的种类和外植体类型显著影响玻璃苗的发生。如瑞香基部茎段产生试管苗玻璃化率最低，茎尖的次之，中部茎段产生的玻璃苗百分率极高。瑞香茎尖外植体大小与玻璃化也有关，茎尖外植体越小，出现玻璃苗比率越大；但留兰香基部节段所形成的试管苗玻璃苗严重，中部茎段次之，茎尖最好；重瓣丝石竹中部茎段出现玻璃苗较多，基部茎段较少，茎尖没有。瑞香茎尖外植体大小与玻璃化相关，茎尖外植体越小，出现玻璃苗比率越大；用青花菜花蕾诱导所分化的不定芽有74%表现正常，而用子叶、上胚轴和花序柄诱导的不定芽全为玻璃化苗。然而，这些研究没有进行机理研究，因此这些结果只能说是一种现象。

2．培养基水势和环境湿度的影响

试管苗出现玻璃化主要是由于培养体系的水分状况不适而导致的一种生理性病变。已经证实，液体培养比固体培养更容易产生试管苗玻璃化，提高培养器皿内空间相对湿度容易产生玻璃化。琼脂和蔗糖浓度与玻璃化成负相关，琼脂或蔗糖浓度越高，玻璃苗的比率越低。蔗糖作为植物组织培养中的碳源，对植物细胞的碳结构和渗透势都有很大的影响。在对山核桃研究中，当添加蔗糖质量浓度低于20.0g·L^－1时，出现大量的玻璃化苗，试管苗叶片畸形，呈半透明状，植株生长停滞。可能是因为过低的蔗糖质量浓度，会使培养基环境中的水势升高，植物组织吸水过多，叶片呈水渍状。同时植物生长环境中的含碳量降低，使植物的干物质积累量减少，细胞结构建成受到影响，从而引起玻璃化现象；琼脂已公认为是一种中性支撑物，许多研究表明琼脂含量低是形成玻璃化的重要影响因素之一，适当增加琼脂质量浓度（5.5～6.0g·L^－1），可降低培养基中的衬质势。

降低培养容器中的相对湿度，也可以降低玻璃苗的比例。如丝石竹玻璃苗叶片的水势约为正常苗的1.9倍，含水量为正常苗的2.09～2.21倍。因此可以断定，试管苗玻璃化可能是培养基内水分状态不适应的一种生理变态。但有人在枣组培苗研究中发现琼脂浓度与组培苗玻璃化没有关系，这可能是不同组培植物对不同琼脂浓度反应的不同所致。所以，水分生理异常究竟是玻璃化发生的原因，还是伴随的结果，有待于进一步研究。

3．生长调节物质

已证明培养基中BA浓度越高或培养温度越高，玻璃苗比率越大。有研究认为BA是试管苗玻璃化的根源之一，一定的BA浓度诱导细胞分裂活性增强，加上衬质势高，新分裂的细胞膨胀、伸长，打乱了正常的生长发育过程，出现不平衡，产生玻璃苗。在瑞香茎尖培养时，当激素为KT2.0mg·L^－1＋IBA0.1mg·L^－1时玻璃苗百分率为8.3%，当为BA2.0mg·L^－1＋NAA0.2mg·L^－1时则为37.5%，差异十分显著。玻璃化苗的一个重要特征是叶脉明显加长，而GA₃也有类似效应，也许GA₃促进了细胞过度伸长，从而导致玻璃化。许多研究表明，玻璃化被认为是一种非受伤胁迫条件下形态上的反应，乙烯促进了叶绿素分解及细胞的畸形发展，乙烯处理破坏了膜的结构，随着细胞壁解离，细胞内积累了大量纤维素及泡状物质。可见，乙烯对玻璃化的影响，与改变组织的生理生化及纤维结构有关。

4．其他因素的影响

pH值的不适宜是引起玻璃苗的成因之一。pH值5.4～5.8较适合香蕉组培苗的生长，玻璃化现象也较轻；有研究认为玻璃苗是培养瓶内气体与外界交换不.造成的，密闭的封瓶口材料是导致玻璃化的原因之一；培养基中高的含N量，特别是高的氨态N，也是导致玻璃化的因素；黑暗和弱光培养容易形成玻璃苗，而光照则可以显著降低玻璃苗百分率。(www.xing528.com)

（二）防止和克服玻璃苗的措施

尽管关于玻璃化的成因及其生理机制到目前为止仍未得出一致的结论，但对某些植物的玻璃化已得到有效的控制。这些研究表明，控制试管苗玻璃化主要针对以上原因采取相应的措施。主要从培养的环境条件和生理生化方面入手，具体措施如下：

1．改善培养环境

①利用固体培养，增加琼脂浓度，降低培养基的衬质势，造成细胞吸水阻遏。如提高琼脂浓度，可降低玻璃化；适当提高培养基中蔗糖含量或加入渗透剂，降低培养基中的渗透势，减少植物材料可获得的水分，造成水分胁迫；降低培养容器内部环境的相对湿度。

②适当降低培养基中细胞分裂素和赤霉素的浓度。

③控制温度。适当低温处理，避免过高的培养温度；在昼夜变温交替的情况下比恒温效果好；增加自然光照。试验发现，玻璃苗放于自然光下几天后茎、叶变红，玻璃化逐渐消失，因自然光中的紫外线能促进试管苗成熟，加快木质化。改善培养容器的通风换气条件，如用棉塞或通气好的封口膜封口。

2．调控生理生化代谢

①增加培养基中Ca、Mg、Mn、K、P、Fe、Cu、Mn元素的含量，降低N和Cl元素比例，特别降低铵态氮浓度，提高硝态氮含量。

②青霉素G钾（2～6mg·L^－1）能有效防治菊花试管苗的玻璃化，青霉素（40万单位·L^－1）可降低芥菜试管苗的玻璃化。培养基中加入间苯三酚或根皮苷。

③用40℃热击处理瑞香愈伤组织培养物，可完全消除再生苗的玻璃化，且能够提高愈伤组织的芽分化频率，热击处理会降低内源细胞分裂素水平。

④一些添加物可有效地减轻或防治玻璃化，如添加马铃薯汁或活性炭降低了油菜玻璃苗频率，用10～15mg·L－1的CCC或0.5～1.0mg·L－1的PP₃₃₃减少了重瓣丝石竹试管苗玻璃化的发生；添加1.5～2.0g·L^－1的聚乙烯醇防治苹果砧木玻璃化；增加容器中乙烯含量克服香石竹玻璃化的发生。

尽管如此，不同植物在不同条件下，也许会得出不同的结论或相反的结果。更有效的玻璃化控制途径，有待于进一步研究。